水稻淀粉合成相关基因分子标记的筛选与利用

刘燕清， 强新涛， 赵春芳， 于 新， 姚 姝， 周丽慧， 陈 涛， 赵庆勇，朱 镇， 张亚东， 王才林

(1.南京农业大学农学院/江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院粮食作物研究所/江苏省优质水稻工程技术研究中心/国家水稻改良中心南京分中心，江苏 南京 210014)

淀粉是稻米胚乳中最主要的成分，占精米的90%，由直链淀粉和支链淀粉组成，其中直连淀粉含量一直以来被认为是衡量稻米食味品质的最重要指标［1-3］。直链淀粉是由蜡质基因(Wx)编码的颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)催化而成的。支链淀粉由可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)以及淀粉去分支酶(DBE)等协同合成。在淀粉合成途径中已报道了20多个相关基因参与编码这些酶类，包括编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大小亚基的AGPlar、AGPis、AGPsma基因及由不同剪接方式产生的多个基因，编码淀粉合成酶的基因 Wx、GBSSII、SSI、SSIIa、SSIIb、SSIIc、SSIIIa、SSIIIb、SSIVa、SSIVb，编码淀粉去分支酶的基因SBE1、SBE3、SBE4以及编码去分支酶的ISA、PUL基因等［4-6］。近年来有学者认为淀粉磷酸化酶和歧化酶也参与了淀粉合成，其编码基因有PHO1、PHO2和DPE等［7］。面对如此众多的参与淀粉合成的调控基因，要研究它们对稻米食味品质的遗传效应，应该首先明确它们在基因组水平上的基因型差异。

淀粉合成相关基因在水稻种质资源中存在着丰富的自然变异这些等位变异决定了稻米品质性状的多样性表现，在大量资源中挖掘淀粉合成相关基因的优异等位变异是品质性状育种改良的重要研究内容［8］。目前，国内已经对淀粉合成相关基因进行了序列分析，并设计了有效的基因型检测分子标记。谢会兰［9］对13个品质性状上有差异的水稻品种中的18个淀粉合成相关基因进行了测序，在基因序列上的InDel及SNP特异位点处有选择地进行标记设计，研究了这些标记在复等位基因研究方面的应用潜力。李刚［10］基于水稻籼粳亚种数据库比对，开发了淀粉合成相关基因的15个分子标记，根据各基因标记所划分的基因型来分析非糯材料淀粉理化特征值的差异。田志喜等［11］通过分析16个典型水稻品种的淀粉合成相关基因的全基因序列，明确了各基因在不同种质中的等位变异，设计了51个可以区分不同等位基因变异的分子标记。

本研究尽可能多地收集了当前文献资料中的淀粉合成相关基因的分子标记，在不同水稻品种中进行了多态性筛选，并利用筛选到的差异等位基因标记，在粳稻育种后代品系中进行基因型鉴定，为分析淀粉合成相关基因的遗传效应奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

包括3组水稻品种(系)，第一组为17份不同水稻品种，包括6个籼稻品种、8个粳稻品种和3个糯稻品种;第二组为28份粳稻亲本，主要为全国各省的主栽品种;第三组为来源于关东194/武粳13组合后代的88份稳定品系。

供试材料于2013年5月～10月种植在江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田。5月10日播种，6月10日移栽，常规管理。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 移栽后30 d取幼嫩叶片，采用 CTAB 法［12］提取 DNA。

1.2.2 淀粉合成相关基因分子标记引物设计 利用文献报道的淀粉合成途径中的调控基因及所用到的分子标记信息［13-15］，由上海英俊生物科技有限公司合成分子标记检测引物，共合成了83对引物，包括STS和CAPS标记。

1.2.3 DNA片段扩增与酶切 PCR反应在Eppendorf-5330 PCR 仪上扩增，总体积 10.00 μl，其中dd H2O 6.55 μl，10 × Buffer 1.00 μl，dNTP 0.20 μl，Taq DNA 聚合酶 0.50 μl，上、下游引物各 1.00 μl，模板DNA 1.00 μl。PCR扩增采用94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共33个循环。酶切体系:PCR扩增产物10.00 μl，内切酶 1.00 μl，10 × Buffer 2.00 μl，0.1%BSA 2.00 μl，dd H2O 5.00 μl。酶切时间为 1 h。产物用1.5%的琼脂糖凝胶或者9.0%的聚丙烯酰胺电泳检测。试验中所用内切酶均购于TaKaRa公司。

1.2.4 聚类分析 PCR扩增产物根据扩增带的有无按1、0统计建立数据矩阵。在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”。每2份材料间的遗传差异按Nei等［16］的方法计算遗传相似性系数和遗传距离。根据所得遗传相似系数，利用 NTSYS-pc Version 2.0 软件［17］，用其中的 UPGMA方法进行遗传相似性聚类。

2 结果与分析

2.1 淀粉合成相关基因分子标记在籼粳亚种间的多态性

利用文献报道的淀粉合成相关基因的83个分子标记［13-15］，对6个籼稻品种、8个粳稻品种和3个糯稻品种进行等位基因多态性检测。83个标记中60个能够进行很好的PCR扩增，其中48个具有多态性，多态率为80%。利用48个多态性标记的分子数据，计算17个水稻品种的遗传相似性系数，其范围在0.88～1.00。以遗传相似性系数0.97为阈值，进行UPGMA聚类分析，得到17个品种的淀粉合成相关基因分子数据的聚类图(图1)。由图1看出，供试材料被分成3大类:第I类为粳稻分支，包括所有粳稻品种和2个糯稻品种，其中武粳13的遗传背景与其他粳稻或糯稻有明显差异，其他粳稻或糯稻间的基因序列保守性很高;第II类包括2个籼稻品种(9311和明恢63)和1个糯稻品种(苏御糯)，与第I类同处于1个主分支上，说明该类水稻品种的淀粉合成相关基因的序列更接近于粳稻;第III类包括4个籼稻品种(珍汕97B、龙特普B、桂朝2号和扎西玛)，珍汕97B和龙特甫B的基因序列一致，与其余两籼稻品种间均存在明显差异。聚类图可以反映出，淀粉合成相关基因在粳稻中具有较高的保守性，在籼稻中变异较大，籼稻品9311和明恢63具有更偏向于粳稻背景的基因型。

图1 淀粉合成相关基因分子标记在17个水稻品种中的聚类分析Fig.1 Clustering analysis of 17 rice varieties

2.2 淀粉合成相关基因分子标记在粳稻品种间的多态性

粳稻品种间的淀粉合成基因相对保守，序列变异性较低，只能筛选到与武粳13有差异的2个基因型，因此，为了获得更多有等位基因差异的粳稻品种，我们扩大了粳稻品种的数目，选择了28个粳稻育种中广泛使用的亲本材料进行进一步筛选。利用48对在籼、粳、糯间具有多态性的分子标记进行多态性检测，筛选到6个淀粉合成相关基因(SSIIa、SSIIIa、SSIIIb、SBE3、ISA、PUL)上的分子标记具有多态性，其中SSIIa和SSIIIb存在3种等位基因型，其余4个基因均存在2种等位基因型，图2为6个基因上的分子标记检测结果。

2.3 可溶性淀粉合成酶基因SSIIa、SSIIIa分子标记在粳稻育种品系中的检测

在粳稻亲本的筛选结果中，发现可溶性淀粉合酶基因SSIIa和SSIIIa的分子标记在关东194和武粳13间均表现出多态性。因此，利用SSIIa和SSIIIa的分子标记对关东194和武粳13杂交组合的88份后代衍生系进行了基因型检测。在88份品系中分别检测到SSIIa关194SSIIa关194和 SSIIa武13SSIIa武13基因型的品系分别为30个和58个，SSIIIa关194SSIIIa关194和SSIIIa武13SSIIIa武13基因型的品系分别为69和19个，检测到2个基因的4种 基 因 型 SSIIa关194SSIIa关194/SSIIIa关194SSIIIa关194、SSIIa关194SSIIa关194/SSIIIa武13SSIIIa武13、SSIIa武13SSIIa武13/SSIIIa关194SSIIIa关194和SSIIa武13SSIIa武13/SSIIIa武13SSIIIa武13的品系分别为12个、18个、57个和1个(表1)。

图2 淀粉合成相关基因分子标记在28个粳稻亲本中的检测结果Fig.2 The classification of 28 japonica rice based on the polymorphisms by the markers for six genes

表1 88份关东194/武粳13杂交育种品系的基因型检测Table 1 Genotypic detection of 88 breeding lines derived from Guandong 194/Wujing 13

3 讨论

近年来，随着分子生物学的不断发展，分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中发挥着极其重要的作用。如利用SSR标记建立水稻品种的DNA指纹图谱［18］，利用稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因内标记检测抗病品种［19］，利用抗条纹叶枯病基因(Stv-bi)的SCAR标记定向改良水稻品种的条纹叶枯病抗性［20-21］。低直链淀粉含量基因(Wx-mq)的CAPs和四引物标记在优质育种中也有广泛应用，利用分子标记已经培育出一系列含Wx-mq基因的优良食味粳稻品种如Milky Queen、关东194、南粳46、南粳9108等［22-25］。为了获得更多具有利用价值的优良食味基因，本研究利用分子标记检测的方法，对淀粉合成途径中所有调控基因的基因型对17份籼、粳品种和28份粳稻亲本进行了系统筛选。17份籼、粳品种的检测结果表明，淀粉合成相关基因在籼粳亚种间表现出良好的多态性，在籼稻亚种内的变异较大，而在粳稻亚种内则相对保守，序列相似性较高。另外我们发现籼稻品种9311和明恢63中的淀粉合成相关基因的基因型更接近于粳稻，可能由于它们基因组上包含了粳稻背景如9311基因组被认为含30%的粳稻序列的缘故。该研究结果与前人利用SSR标记对不同水稻品种全基因组遗传多样性的鉴定结果［26-29］是相似的，从而说明了在水稻亚种间，淀粉合成相关基因的序列变异特征与其整个基因组序列的变异是一致的。

目前较多的研究结果表明，中国粳稻品种间特别是江苏省育成的粳稻品种间遗传多样性单一，程宝山等［30］研究发现江苏粳稻主栽品种遗传相似系数为0.75～0.98，变异幅度很小。赵庆勇等［31］研究结果表明，江苏省育成的水稻品种遗传多样性不够丰富，多数品种间亲缘关系较近。鉴于粳稻品种间遗传背景单一的情况，我们在对28份粳稻亲本的淀粉合成相关基因分子标记检测结果中，仍特异性地筛选到6个基因的差异标记，找到了一些含差异等位基因的亲本。如武粳13与关东194、宁0145等品种在可溶性淀粉合成酶基因SSIIa和SSIIIa上有等位基因差异，金粳18与关东194等品种在淀粉分支酶基因ISA和去分支酶基因PUL上有基因差异。我们对SSIIa和SSIIIa的分子标记在武粳13与关东194配置组合的后代品系中进行了验证，获得了一些含单基因和双基因组合的材料，但是很遗憾我们只获得1份含SSIIa武13SSIIIa武13双基因型的材料，可能后续还需要增加检测的样本数量。另一方面，在后期研究中我们将测定这些品系的食味品质性状，如直链淀粉含量、糊化温度、胶稠度等淀粉相关理化参数，根据基因型与表型数据的差异显著性分析，明确SSIIa和SSIIIa不同基因型间及双基因组合间的遗传效应大小，从而为粳稻品种食味品质的改良提供有用的基因型。

本研究通过对淀粉合成途径上调控基因分子标记在不同品种间多态性的系统筛选，明确了含差异等位基因的水稻材料，证实了淀粉合成相关基因分子标记对育种材料进行基因型筛选的可行性，该研究结果为后续淀粉合成相关基因对食味品质的遗传效应分析奠定了良好基础，为水稻食味品质改良中的亲本选择、杂交后代的基因型筛选以及食味品质的定向改良提供了重要信息。

［1］ 周龙祥，唐摇设，刘正辉，等.开花期剪叶和疏花对宁粳1号和镇稻88稻米直链淀粉含量和胶稠度的影响［J］.江苏农业学报，2014，30(5):943-949.

［2］ 管仁贵，柳 婵，褚菲菲.正交设计优化制备淀粉接枝 AMPS高吸水树脂［J］. 江苏农业科学，2014，42(10):265-267.

［3］ 姚二民，张超帅，李 晓，等.多孔淀粉茶叶包埋颗粒在卷烟过滤器中的应用［J］.江苏农业科学，2014，42(12):311-313.

［4］ HANNAH L C，JAMES M.The complexities of starch biosynthesis in cereal endosperms［J］.Curr Opin Biotechnol，2008，19:160-165.

［5］ NAKAMURA Y.Towards a better understanding of the metabolic system for amylopectin biosynthesis in plants:Rice endosperm as amodel tissue［J］.Plant Cell Physiol，2002，43:718-725.

［6］ JAMES M G，DENYER K，MYERS A M.Starch synthesis in the cereal endosperm［J］.Curr Opin Plant Biol，2003，6:215-222.

［7］ OHDAN T，FRANCISCO P B.Expression profiling of genes involved in starch synthesis in sink and source organs of rice［J］.Breeding Science，2005，56(422):3229-3244.

［8］ ZHAO W，CHUNG J，KWON S，et al.Association analysis of physicochemical traits on eating quality in rice(Oryza sativa L.)［J］.Euphytica，2013，191(1):9-21.

［9］ 谢会兰.水稻淀粉合成相关分子标记的建立及其遗传网络初步探析［J］.作物学报，2007，10(1):47-54.

［10］李 刚.水稻淀粉合成相关基因分子标记的开发及稻米淀粉RVA谱特征与品质性状的相关性研究［D］.雅安:四川农业大学，2008.

［11］田志喜，严长杰，钱 前，等.水稻淀粉合成相关基因分子标记的建立［J］.科学通报，2010，55(26):2591-2601

［12］ ROGERS S O，BENDICH A J.Extraction of DNA from plant tissues［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2012，54(12):979-990.

［13］万映秀.水稻淀粉生物合成途径中关键酶基因分子标记的开发及应用［D］.雅安:四川农业大学，2006.

［14］蔡秀玲，刘巧泉，汤述翥，等.用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记［J］.植物生理与分子生物学报，2002，28(2):137-144.

［15］严长杰，田 舜，张正球，等.水稻栽培品种淀粉合成相关基因来源及其对品质的影响［J］.中国农业科学，2005，39(5):865-871.

［16］ NEI M，LI W M.Athematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonuclease［J］.Proc Nat l Acad Sci USA，1979，76:5269-5273.

［17］ ROLF F J.Numerical taxonomy and multivariate analysis system［M］.New York:Exeter Publication，1990.

［18］李茂柏，王 慧，白建江，等.利用SSR分子标记构建水稻品种DNA指纹图谱的研究进展［J］.中国稻米，2011，17(1):4-6.

［19］何 重，陈 涛，张亚东，等.江苏部分粳稻品种和品系中稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因型分析［J］.江苏农业学报，2014，30(5):921-927.

［20］姚 姝，陈 涛，张亚东，等.分子标记辅助选择改良宁恢8号的条纹叶枯病抗性［J］.中国水稻科学，2014，28(1):85-91.

［21］姚 姝，陈 涛，骆名瑞，等.分子标记辅助选择定向改良武运粳7号的条纹叶枯病抗性［J］.华北农学报，2013，28(4):195-203.

［22］ SATO H，SUZUKI Y，OKUNO K，et al.Genetic analysis of low amylose content in a rice variety［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2001，3(1):13-19.

［23］ TOMITA K，HORIUCHI H，TERADA K，et al.New-hikari，a new rice cultivar［J］.Bull Fukui Agric Exp，2007，44(6):1-20.

［24］王才林，陈 涛，张亚东，等.通过分子标记辅助选择培育优良食味水稻新品种［J］.中国水稻科学，2009，23(1):25-30.

［25］王才林，张亚东，朱 镇，等.优良食味粳稻新品种南粳9108的选育与利用［J］.江苏农业科学，2013，41(9):86-88.

［26］齐永文，张冬玲，张洪亮，等.中国水稻选育品种遗传多样性及其近50年变化趋势［J］.科学通报，2006，51(6):693-699.

［27］丁 立，齐永文，张洪亮，等.中国三系杂交稻恢复系资源的遗传多样性［J］.作物学报，2007，33(10):1587-1594.

［28］张立娜，曹桂兰，韩龙植.中国不同地理来源旱稻地方品种的遗传相似性研究［J］.中国农业科学，2010，43(17):3481-3488.

［29］ QI Y W，ZHANG H L，ZHANG D L，et al.Assessing indica-japonica differentiation of improved rice varieties using microsatellite markers［J］.Journal of Genetics and Genomics，2009，36:305-312.

［30］程宝山，万志兵，洪德林，等.35个粳稻品种SSR指纹图谱的构建及遗传相似性分析［J］.南京农业大学学报，2007，30(3):1-8.

［31］赵庆勇，张亚东，朱 镇，等.30个粳稻品种SSR标记遗传多样性分析［J］.植物遗传资源学报，2010，11(2):218-223.