预测微生物学在乳及乳制品中的应用

张亚红王 娉 杨海荣 赵勇胜 陈 颖*

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100176；2.南京农业大学食品科技学院）

1 前言

随着中国国民经济的不断发展、居民人均收入水平的提高以及膳食结构的转变，中国乳制品消费与过去相比出现了明显的增长。国家通统计局数据显示[1]，城镇居民家庭人均鲜奶购买数量由1996年的4.6kg逐年上升到2006年的18.3kg，从2007年开始略有降低，之后一直维持在14 kg左右，但频繁发生的乳制品质量安全事件也引发了人们对乳制品安全的关注。乳制品营养丰富，非常适合微生物的生长繁殖，一些微生物可以使乳制品产生特殊的风味，如使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生产发酵乳，而有的会造成乳制品腐败变质，甚至危害人体健康[2-5]，2014年美国曾发生一起奶酪中单增李斯特菌引起的食物中毒事件，造成5人感染，1人死亡[5]。因此，对乳制品中微生物的生存状态进行研究，了解微生物的变化趋势，对保证乳制品质量安全具有重要意义。

预测微生物学（Predictive Microbiology）是以微生物学、统计学、计算机学和数学为基础而建立起来的一门新学科[6]，通过建立数学模型来对特定环境条件下微生物的生长或死亡情况进行预测。预测微生物学现已广泛应用在肉品、水产品、鲜切果蔬和乳制品等领域中，刘超群[7]将预测微生物学与冷鲜猪肉中微生物的控制工艺相结合，建立了4°C储藏下不同浓度热水解单宁处理的冷鲜猪肉中微生物的生长动力学模型，并预测出当热水解单宁达到2.5%时，能将微生物生长的迟滞期延长到7 d，该研究为热水解单宁在冷鲜猪肉中的应用提供了理论指导。将预测微生物学应用到乳制品领域，能够协助完成乳制品的质量安全控制、乳制品中微生物定量风险评估和乳制品生产工艺优化等。本文按照乳制品种类的不同，就预测微生物学在乳制品中的应用情况及存在的问题进行了综述。

2 预测微生物学在乳及乳制品中的应用

2.1 预测微生物学在原料乳中的应用

原料乳营养丰富、水分含量高且pH值接近中性，非常适合微生物的生长与繁殖。如果原料乳储存和运输条件（尤其是温度条件）不适当，极易造成原料乳中微生物生长，使原料乳品质下降，影响后续加工品的质量。因此，要对生产乳制品的源头进行质量安全控制，以确保生产乳制品原料乳的安全。建立原料乳在储存运输过程中的微生物预测模型，可以对特定条件下原料乳中微生物的生长情况进行预测，为原料乳储藏和运输过程中微生物的控制提供理论依据，以减少原料乳中微生物导致的安全事件的发生。金黄色葡萄球菌是原料乳中最常见的一种致病微生物，有关原料乳中的金黄色葡萄球菌微生物预测模型研究相对较多[8-9]，如有学者通过使用3M金黄色葡萄球菌快速测试片、确认片建立了10℃-30℃原料乳中金黄色葡萄球菌的一级Gompertz模型以及二级响应面方程，该研究为预测原料乳储藏和运输中金黄色葡萄球菌的生长提供了定量数据，对金黄色葡萄球菌的控制提供理论依据，同时，对建立原料乳中的金黄色葡萄球菌的风险评估提供了科学工具[8]。除了原料乳中的致病微生物，嗜冷菌因在原料乳低温冷藏时会大量繁殖，而成为影响原料乳品质的另一主要微生物。进行原料乳中嗜冷菌的变化趋势研究，对保证原料乳的安全具有重要指导意义。唐佳妮[10]使用平板计数法和阻抗法两种方法分别建立了杭州地区牧场原料奶中洛菲不动杆菌和荧光假单胞菌两种嗜冷菌的一级Gompertz模型和二级多项式模型，并建立了描述最大生长速率比与电导/导纳最大增长速率比之间关系的立方模型，该研究为原料乳储藏和运输过程中洛菲不动杆菌和荧光假单胞菌的控制提供了理论依据。

2.2 预测食品微生物学在液态乳制品中的应用

巴氏杀菌乳保质期短，同时需要冷藏保存，若保存条件不当，或者保存时间过长，都会造成微生物的生长繁殖，因此建立巴氏杀菌乳中微生物的预测模型，对巴氏杀菌乳的安全保障具有重要意义。李敏[11]从巴氏杀菌乳中分离出假单胞菌及蜡样芽孢杆菌两种优势细菌，并建立了描述两种菌5℃-16℃混合生长规律的一级Baranyi模型和Ratkowsky二级模型，为巴氏杀菌乳中假单胞菌和蜡样芽孢杆菌的控制提供了科学数据，为保证巴氏杀菌奶的安全提供了理论基础，同时也为进行巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的定量风险评估提供了科学工具。除此之外，建立描述某环境因子对巴氏杀菌乳中微生物的生长规律影响的预测模型，对优化巴氏杀菌乳产品配方和生产工艺有重要指导意义。有学者[12]研究了不同添加量（1、2.5、5%，w/v）的肉桂在不同温度（8℃、25℃、36℃）下的巴氏脱脂牛奶中影响鼠伤寒沙门氏菌生长的一级Gompertz模型，结果表明5%的肉桂添加量对鼠伤寒沙门氏菌的生长有抑制作用；在上一步的研究基础上，探究了不同脉冲电场条件（10、20、30 kv/cm，60-3000 μs）对脱脂牛奶中鼠伤寒沙门氏菌生长的影响。最后得出结论，5%的肉桂，10 kv/cm-3000 μs的脉冲条件对脱脂牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用最大，该研究为以添加肉桂和脉冲电场为基础的非热杀菌技术在乳制品生产行业的推广奠定了理论基础。

目前，我国乳品市场已由“乳粉”为主、低温“巴氏杀菌乳”为辅的市场转变为以灭菌乳为主的多品种、多口味的局面[13]。建立不同条件下的灭菌乳中微生物的生长和失活模型能显示某环境因子对微生物生长的影响规律，进而可以对生产、加工、流通等过程中各个环节的微生物控制提供理论依据。国外有学者[14]构建了14℃-36.5℃下金黄色葡萄球菌在灭菌乳中的生长模型和产肠毒素模型，确定了当金黄色葡萄球菌的浓度达到106.5 CFU/mL时，才会产生产毒素，且肠毒素产生量随时间延长呈直线上升，在14℃-32℃温度范围内毒素产生速率与温度呈直线相关关系。该研究为控制灭菌乳中金黄色葡萄球菌生长及其肠毒素的产生提供了科学数据，同时，为进行灭菌乳中金黄色葡萄球菌的定量风险评估提供了有力工具。除了建立微生物在灭菌乳中的生长预测模型，建立描述某环境因子对灭菌乳中微生物的生长规律影响的预测模型还可以协助优化灭菌乳生产工艺，Amina等[15]用小波神经网络建立了全脂UHT乳中单增李斯特菌在 350、450、550、600 MPa 下的失活模型，并选取400、500 MPa的实验数据对模型进行了验证，通过与修正Gompertz模型和修正的Weibull方程进行统计学对比，表明建立的小波神经网络模型可行，并且更精确地描述了单增李斯特菌的失活规律。该模型的建立对优化灭菌乳生产工艺和保障食品安全有重要作用，并推动了非热加工杀菌方法的广泛应用。

2.3 预测微生物学在发酵乳中的应用

GB 19302-2010[16]规定发酵乳中的乳酸菌浓度应 ≥ 1×106CFU/g（mL），建立不同条件下发酵乳中的乳酸菌的预测模型，对发酵乳高品质期的预测，优化发酵条件和产品配方具有指导意义。有学者建立了添加3%保益加麦精的发酵乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长预测模型，并根据预测模型预测出保加利亚乳杆菌的浓度在38 d后才开始低于1×106CFU/mL，嗜热链球菌的浓度在39 d储藏期内始终高于1×106CFU/mL，该研究为发酵乳高品质期的预测和配方的优化提供了科学依据[17]。周康等[18]使用在线软件DMFit建立了从四川发酵乳制品中分离鉴定得到的乳酸乳球菌SQ117在不同温度和pH值下的一级Baranyi生长模型，采用Ratkowsky模型建立了二级模型，为乳酸乳球菌所产生的有益代谢产物的定量研究提供了数据，同时，对优化发酵乳的发酵条件提供了理论依据。除了建立发酵乳中有益菌的预测模型，利用微生物预测模型描述特定条件下发酵乳中有害微生物的生长情况，可以协助确定储藏、运输、配送、销售等环节中质量安全的关键控制点，为发酵乳的加工生产和零售环节有害菌的控制提供参考依据。根霉属、曲霉属、镰刀霉属、青霉属和毛霉属是发酵乳中常见的真菌污染物[19-22]，这些污染的真菌可以在酸奶保质期里生长，从而影响酸奶品质。国外学者研究了发酵乳中不同初始浓度的12种真菌在0℃-40℃储藏温度下的生长特性，并建立了描述每种真菌的生长速率和迟滞期随温度变化的二级预测模型，预测出每种真菌在酸奶上可生长的最低温度，最高温度以及最适温度，并进一步建立了储藏温度和初始添加量对每种真菌迟滞期影响规律的修正CMI模型，该研究为酸奶品质控制和货架期内产品的有效管理提供了理论依据[22]。

2.4 预测食品微生物学在干酪中的应用

干酪是一种未成熟或成熟的软的或者半硬、硬或超硬的即食乳制品，富含蛋白质、乳脂肪、无机盐和维生素及其他微量成分，在国外已成为大众食品。但有关干酪中单增李斯特菌引起的人类李斯特菌病屡有报道，美国疾病预防控制中心（CDC）统计数据显示[5]2011-2015年5月，美国共发生8起单增李斯特菌引起的食源性疾病暴发事件，其中有4起与干酪有关。不同于其他食源性病原微生物，单增李斯特菌能耐受极端温度、pH和盐浓度，可能会在冷藏的高湿度干酪表面生长，并达到使人感染剂量，因此，进行干酪中单增李斯特菌的生长状况研究对保证干酪的质量安全有重要意义。目前，有较多学者对干酪中单增李斯特菌的生长状况进行了研究[24-28]，Tiwari等[28]研究了分别以鲜奶和巴氏杀菌乳为原料制作的干酪，在不同储存温度下成熟过程中单增李斯特氏菌浓度的变化，并建立了干酪中单增李斯特氏菌的一级生长预测模型，该研究为食品经营者预测干酪储存过程中单增李斯特氏菌的生长提供定量数据，同时，为干酪储藏过程中单增李斯特氏菌的控制提供理论依据。

综上所述，预测食品微生物学在乳制品行业中的应用比较广泛，不仅包括对目标微生物在一定条件下的生长进行预测，还将目标菌的生长/失活模型与抑菌技术相联系，为乳制品生产工艺的改进提供理论基础。另外，有的研究致力于新模型的开发，对目标菌生长过程中浓度测定方法的研究，还有将其应用到风险评估、产品配方优化等方面。

3 预测食品微生物学在乳及乳制品领域中存在的问题

3.1 研究内容较单一

乳制品的种类较多，如奶粉、发酵乳、巴氏杀菌乳、UHT乳、干酪等，相关的微生物种类也较多，如嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、沙门氏菌、肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、大单增李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌等，因此，（乳制品，微生物）组合较多，目前的研究较单一，如预测微生物学在原料乳方面的研究多集中于金黄色葡萄球菌，对其他原料乳中常见病原微生物的研究较少。因此，预测微生物学在乳制品领域还有很多工作尚待完成。

3.2 模型的准确性有待提高

乳制品中建立的有关模型一般采用纯培养方式或者未考虑微生物间的竞争抑制作用，但是乳制品是一个复杂的体系，其营养成分及乳制品中的其他微生物都会对目标菌的生长产生影响，可能与真实情况有较大偏差，不宜于实际应用，如Dens[29]人工污染植物乳杆菌和大肠杆菌混合菌种在低扩散系数的食品（固体食品）可以共存，而这种情况在均质液态培养基中不会发生。另外，乳制品中微生物模型大都是在温度、pH值、Aw等恒定条件下建立，可以对相似恒定条件下微生物生长情况进行预测。但是，乳制品生产和流通过程中的环境条件不可避免会发生变化，建立在恒定条件下的模型便不能很好地适用于真实情况[30]。

3.3 对数据测定方法研究较少

乳制品中预测模型建立过程中数据的获得一般采用平板计数法，该法虽然可以区分死菌和活菌，具有较高的准确性，但工作量大、耗时、费力。因此，需要寻求新的方法来建立预测模型。已有研究报道[31]采用基于DNA实时荧光定量PCR方法进行模型的建立，但因其无法区分死菌和活菌，使用受到限制。为克服这一问题，有研究者[32]对在死菌中易降解的RNA进行反转录，再进行实时荧光定量PCR，实现对微生物浓度的间接测定。另外，还有研究者[33]采用宏基因组的方法建立微生物预测模型。预测食品微生物学在乳制品领域中也应寻求新的数据获取方法，以提高模型的建立速度，减少科研工作者的劳动时间。

4 结语

预测模型因其能够快速预测微生物在不同环境变量条件下的响应情况，从而了解不同环境因素对微生物生长的影响，在乳制品领域有着广泛应用。随着微生物预测模型的快速发展，预测微生物学在乳制品中的应用会更广泛，贡献也将越来越大。但是，也应注意到预测微生物学在乳及乳制品中的应用中尚存在不足，在研究过程中还需要不断探索、创新，建立更加适用的预测模型。

[1]http：//data.stats.gov.cn/easyquery.htm?cn=C01.

[2]Johler S， Weder D， Bridy C， et al.Outbreak of staphylococcal food poisoning among children and staff at a Swiss boarding school due to soft cheese made from raw milk[J].Journal of dairy science，2015， 98（5）：2944-2948.

[3]Heuvelink A E，van Heerwaarden C，Zwartkruis-Nahuis A，et al.Two outbreaks of campylobacteriosis associated with the consumption of raw cows'milk[J].International journal of food microbiology， 2009，134（1）：70-74.

[4]唐军.中山市古镇某幼儿园金黄色葡萄球菌食物中毒事件流行病学调查报告 [J].中国社区医师： 医学专业，2012，14（25）：379-380.

[5]http：//www.cdc.gov/listeria/outbreaks/index.html.

[6]McMeekin T A， T Ross.Shelf life prediction： Status and future possibilities[J].International Journal of Food Microbiology，1996，33（1）：65-83.

[7]刘超群.冷鲜猪肉中微生物预测模型的建立及控制工艺研究[D].武汉工业学院，武汉，2011.

[8]闫军，遇晓杰，汤岩，等.金黄色葡萄球菌在生乳中生长预测模型的建立[J].中国食品卫生杂志，2010，06：502-505.

[9]赵鑫，鞠世颖，周颖，等.基于Matlab的原料乳中金黄色葡萄球菌生长模型的分析[J].食品研究与开发，2014，06：99-104.

[10]唐佳妮.阻抗法建立原料奶中主要微生物生长模型的研究[D].杭州：浙江大学，2011.

[11]李敏.巴氏杀菌奶中优势微生物预测模型的建立及风险评估[D].中国农业大学，北京，2006.

[12]Pina-Pérez M C， Martínez-López A， Rodrigo D.Cinnamon antimicrobial effect against Salmonella typhimurium cells treated by pulsed electric fields （PEF） in pasteurized skim milk beverage[J].Food Research International， 2012， 48（2）：777-783.

[13]陈历水，丁庆波.我国乳制品发展现状及趋势 [J].乳业科学与技术， 2013， 35（6）： 37-41.

[14]FujikawaH， MorozumiS.Modeling Staphylococcusaureus growth and enterotoxin production in milk[J].Food Microbiology， 2006， 23（3）：260-267.

[15]Amina M， Panagou E Z， Kodogiannis V S， et al.Wavelet neural networks for modelling high pressure inactivation kinetics of Listeria monocytogenes in UHT whole milk[J].Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems， 2010， 103 （2）：170-183.

[16]GB 19302-2010发酵乳[S].

[17]陈如琪，吕宝龙，刘少伟.保益加麦精对酸奶中益生菌生长影响预测模型的建立[J].食品工业，2013，03：166-169.

[18]周康，魏君，蒋翠莲，等.乳酸乳球菌SQ117在不同温度和pH值条件下的生长动力学[J].食品科学，2014，07：192-195.

[19]Lee S C， Billmyre R B， Li A， et al.Analysis of a foodborne fungal pathogen outbreak：virulence and genome of a Mucor circinelloides isolate from yogurt[J].MBio， 2014， 5（4）：1-12.

[20]Sulaiman I M，Jacobs E，Simpson S，et al.Molecular Identification of Isolated Fungi from Unopened Containers of Greek Yogurt by DNA Sequencing of Internal Transcribed Spacer Region[J].Pathogens， 2014， 3（3）：499-509.

[21]Obire O，Berembo B T.Microorganisms associated with street vended yoghurt in mile 1 Diobu area of Port Haecourt，Nigeria[J].e-Journal of Science&Technology， 2014， 9 （5）：179-186.

[22]Ndagijimana M， Chaves-López C， Corsetti A， et al.Growth and metabolites production by Penicillium brevicompactum in yoghurt[J].International journal of food microbiology， 2008，127（3）：276-283.

[23]Gougouli M， Kalantzi K， Beletsiotis E， et al.Development and application of predictive models for fungal growth as tools to improve quality control in yogurt production[J].Food microbiology， 2011， 28（8）：1453-1462.

[24] østergaard N B， Eklöw A， Dalgaard P.Modelling the effect of lactic acid bacteria from starter-and aroma culture on growth of Listeria monocytogenes in cottage cheese[J].International journal of food microbiology， 2014， 188：15-25.

[25]Valero A，Hernandez M，De Cesare A，et al.Survival kinetics of Listeria monocytogenes on raw sheep milk cured cheese under different storage temperatures[J].International journal of food microbiology， 2014， 184：39-44.

[26] østergaard N B， Christiansen L E， Dalgaard P.Stochastic modelling of Listeria monocytogenes single cell growth in cottage cheese with mesophilic lactic acid bacteria from aroma producing cultures[J].International journal of food microbiology，2015， 204：55-65.

[27]Møller S M， Bertram H C， Andersen Uif， et al.Physical sample structure as predictive factor in growth modeling of Listeria innocua in a white cheese model system[J].Food Microbiology， 2013， 36（1）：90-102.

[28]Tiwari U， Walsh D， Rivas L， et al.Modelling the interaction of storage temperature， pH， and water activity on the growth behaviour of Listeria monocytogenes in raw and pasteurised semi-soft rind washed milk cheese during storage following ripening[J].Food Control， 2014， 42（0）：248-256.

[29]Dens E J，Van Impe J F.On the importance of taking space into account when modeling microbial competition in structured food products[J].Mathematics and Computers in Simulation，2000， 53（4-6）：443-448.

[30]韩北忠，李敏，张琳，等.预测微生物学与食品质量安全[J].中国酿造，2005，09：1-3.

[31]彭织云，王敬敬，唐晓阳，等.运用 Real-time quantification PCR方法建立副溶血性弧菌在即食虾中的生长预测模型[J].食品工业科技， 2013， 34（8）：108-110.

[32]Ye K， Wang hu hu， Zhang xin xiao et al. Development andvalidation of a molecular predictive model to describe thegrowth of Listeria monocytogenes in vacuum-packaged chilledpork[J]. Food Control， 2013， 32（1）：246-254.

[33]Delhalle L，Taminiau B，Ellouze M，et al.Predictive microbiology combined with metagenomic analysis targeted on the 16S rDNA：A new approach for food quality[C]//8th International Conference on predictive microbiology in foods（ICPMF8）.Institut Pasteur， 2013.