椎间盘脱出模型大鼠脊髓血管生成因子mRNA的表达变化及电针对其影响

吴伟澎，李伟，程鹏，姜代勋，陈武

(1．北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室;2．北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

椎间盘脱出是人和动物常见病，针灸疗法显示了良好的疗效。髓核脱出压迫脊髓导致机能障碍与微循环障碍和微血管数量变化密切相关［1］。本实验室前期研究表明椎间盘脱出压迫模型大鼠的脊髓微血管数量异常减少，而电针组能够改善这种异常变化［2］，但其机理不明。血管生成因子与血管生成抑制因子、血管破坏因子之间的动态平衡是维持微血管的数量和结构稳定性的重要因素［3］，本研究通过观察血管生成因子血管生成素1 (angiopoietin-1，Ang-1)、血管生成素2 (angiopoietin-2，Ang-2)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及它们的受体Tie-1、Tie-2、Flt-1，血管生成抑制因子凝血酶敏感蛋白1 (thrombospondin-1，Tsp-1)，细胞凋亡因子caspase-3 在脊髓受压损伤后表达量的变化以及电针对其的影响，为针灸治疗椎间盘病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

东华牌电针治疗仪(WQ-6F);毫针(苏州天协针灸器械有限公司，规格0.2 ×25 mm);微动力仪(Surgic XT，NSK，Japan);Step One Plus 荧光定量PCR 仪(ABI);戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，德国进口分装);注射用青霉素钾160 万单位、注射用硫酸链霉素50 万单位;TRIzol (Invitrogen);Revert Aid TM First Stand cDNA Synthesis Kit (Thermo);Trans Start Grenn qPCR Super Mix (Trans Gen Biotech)。

1.2 实验动物分组

清洁级雄性SD 大鼠18 只，体重180 ～200 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供【SCXK-(军)2012-004】，实验在北京农学院屏障动物实验设施进行【SYXK (京)2010 -0003】，并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。实验动物随机分成三组，即电针治疗组(n =6)、模型组(n=6)、假手术对照组(n =6)。电针组和模型组进行脊髓压迫，假手术组只暴露脊髓不压迫。电针组进行电针治疗，对照组和假手术组不做任何治疗。

1.3 椎间盘脱出模型制作

大鼠椎间盘脱出模型参考文献［4］，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/(kg·bw)进行麻醉，俯卧保定，以胸腰段椎体为中心剃毛、消毒，以第一腰椎(L1)为中心，沿背正中线切开皮肤约2 cm，分离筋膜、背最长肌、多裂肌，充分暴露L1的棘突、椎板和关节突，微动力仪小心打磨椎板，暴露脊髓背侧，将自制的硅胶片从L1的左侧填塞入至T13段脊髓的左腹侧位，假手术组则只暴露脊髓，不进行压迫。分层缝合肌肉、皮肤关闭切口。术后每只大鼠肌肉注射青霉素钾30 000 U/(kg·bw);硫酸链霉素15 mg/(kg·bw)，2 次/日，连用3 d。单独分笼饲养，正常供给饮水和饲料，人工帮助排尿、排便，每日三次。

1.4 穴位选取与电针方法

电针治疗组，根据本课题组前期研究，选用以下三组穴位:左右膀胱俞(BL28);左侧足三里(ST36)、趾间(EX-LE10);右侧足三里(ST36)、趾间(EX-LE10)，每组分别接通电针仪，频率2 Hz，幅度为5，每天一次，每次20 min，连续治疗7 d。

1.5 运动机能评分

采用BBB 运动机能评分法［5］，于术前、术后每日，对大鼠左、右后肢分别进行运动机能评分，其中第1 天在大鼠从麻醉状态完全清醒后开始评分。

1.6 标本收集

术后第7 天，在麻醉状态下，500 mL 生理盐水进行心脏灌注，在冰块上快速取出脊髓，从压迫正中向头侧取3 mm 用于RT-PCR 检测，向尾侧取3 mm用于病理学检测。

1.7 病理学检测

脊髓组织在4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水、组织包埋、切片、HE 染色，显微镜下观察脊髓损伤情况。

1.8 RT-PCR 检测

取50 mg 脊髓组织，用TRIzol 提取总RNA，按RevertAid TM First Stand cDNA Synthesis Kit 说明书反转录为cDNA，根据文献［6，7］选取与血管生成相关因子引物(见表1)，扩增条件:95℃预变性2 min;94℃20 s;57 ～63℃20 s;72℃30 s，循环40 次。拷贝CT 值，采用2－ΔΔCt法进行分析。

表1 血管生成相关因子基因引物Tab．1 The primers of the related-angiogenic genes

1.9 分析方法

2 结果分析

2.1 电针对椎间盘脱出模型大鼠后肢运动机能的影响

造模后大鼠的运动机能评分迅速降为零，随着时间的延长，后肢运动机能逐渐恢复(见图1-A，B)。对第1、4、7 天数据进行统计分析，由图1-C 和图1-D 可知，在第4 天和第7 天，电针组大鼠的左、右后肢运动机能评分极显著高于模型组(P ＜0.01)。电针组第7 天大鼠的左、右后肢运动机能评分极显著高于第4 天(P ＜0.01);模型组第7 天大鼠的左后肢运动机能评分与第4 天相比差异无显著性(P ＞0.05)，第7 天右后肢运动机能评分显著高于第4 天(P ＜0.05)。表明电针能显著改善椎间盘脱出模型大鼠的后肢运动机能。

2.2 组织病理学变化

电针组神经元多完好，尼氏小体可见，灰质与白质分界明显，轴索与髓鞘多完整排列有序，偶见空泡化。模型组，神经元少见且多损伤，尼氏小体消失，灰质与白质边界模糊不清，残存的白质中可见到不完整的轴索和髓鞘，多空泡化(见图2)。

2.3 电针对血管生成相关因子的mRNA 表达的影响

由图3 可知，模型组与假手术组相比Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 极显著升高(P ＜0.01)，VEGF、Flt-1 差异无显著性(P ＞0.05);模型组与电针组相比Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1极显著升高(P ＜0.01)，Ang-1、VEGF、Flt-1 无显著性变化(P ＞0.05);电针组与假手术组各指标差异均无显著性(P ＞0.05)。结果显示，模型组Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 的mRNA 的表达量异常高于假手术组和电针组，电针组与假手术组各指标差异均无显著性，提示电针能维持血管生成相关因子的mRNA 表达的相对稳定并使之接近机体正常水平。

图1 电针对椎间盘脱出模型大鼠后肢运动机能的影响Fig．1 Effects of electroacupuncture on the hind limb motor function in the rat models of intervertebral disc herniation

图2 电针组(A)，假手术组(B)，模型组(C)，脊髓腹角形态学观察(标尺=50 μm)Fig．2 Pathological changes in the anterior horn of spinal cord in the rats of the electroacupuncture group(A)，sham operation group (B)，and model group (C)．HE staining，bar=50 μm．

图3 电针对血管生成相关因子mRNA 表达的影响Fig．3 Effects of electroacupuncture on the changes of mRNA expressions of angiogenesis-related factors

3 讨论

脊髓血管能为脊髓组织运送营养物质，同时移除组织代谢产物，对受损脊髓组织的修复意义重大。而血管结构的稳定与血管生成因子和血管生成抑制因子与细胞凋亡因子关系密切［8］。

脊髓组织受到打击、压迫等损伤后，受损部位出血、水肿、缺氧，局部组织稳态受到破坏，导致大量钙离子内流，自由基大量产生，单胺类物质大量释放，致使血管收缩，脊髓微血管灌注量显著下降，进一步加剧组织缺血缺氧的状态［9］。在低氧环境下机体过量表达的缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)与VEGF 基因转录启动子的结合位点结合，促进VEGF 的表达［10］。VEGF 能促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进血管的新生。新生血管由于缺少血管周细胞和基质细胞，结构稳定性差，渗透性增强，加剧组织出血与水肿，造成脊髓组织二次损伤［11］。在本次试验中，模型组VEGF 和Flt-1 的表达量有所上调，但与电针组和假手术组相比无统计学意义。

Tie-1、Tie-2 是一类酪氨酸受体，Tie-1 能维持血管内皮细胞结构及功能的完整性，促进新生血管的成熟，其配体目前仍不十分清楚;Tie-2 的配体为Ang-1 和Ang-2［12］。Ang-1 和Ang-2 能竞争性与Tie-2 结合并与VEGF 协同作用，参与血管新生，并且在维持新生血管的稳定性中发挥重要作用。Ang-1 与Tie-2 结合时表现为维持血管结构正常;Ang-2 与Tie-2 结合表现为打破血管的正常结构，当在VEGF高度表达的环境下，Ang-2 与Tie-2 结合有利于内皮细胞迁移，促进血管新生，反之则表现为血管的退变［13］。本研究结果中，模型组的Ang-2 与Tie-2 的mRNA 表达都显著上调，VEGF 的mRNA 表达虽有上调，但与电针组和假手术组相比无显著差异，提示模型组存在VEGF 低表达环境引起血管退变的因素。在VEGF 低表达环境中Ang-2 与Tie-2 的结合表现为血管退变，而在模型组Ang-2 与Tie-2 的表达显著高于电针组(P ＜0.01)，提示电针能够减少Ang-2 与Tie-2 的结合，从而有利于维持血管的正常结构。另外，电针组与假手术组的Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2 均无显著差异，提示电针能够调节Ang-1、Ang-2、Tie-2、VEGF 之间的平衡使之接近正常机体水平，维持受损脊髓的血管生成相关因子的相对稳定。本课题组前期研究表明，电针能显著提高压迫部位脊髓血流灌注量，促进神经机能的恢复［4］。本研究观察到电针下调VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2的表达，这可能与电针增加压迫部位脊髓血流灌注量，缓解局部缺氧环境，减轻血管新生造成的二次损伤等相关［11］。

Tsp-1 作为强效血管生成的负性调节因子之一，能与血管内皮细胞上的CD36 受体作用，影响血管内皮细胞释放VEGF，抑制血管内增殖、分化和迁移，从而抑制血管的生成;并能诱导血管内皮的凋亡，破坏血管结构的稳定［14］。Caspase-3 处于凋亡有序级联反应的下游，是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志。TSP-1 能与细胞膜上的CD47 受体结合，上调Caspase-3 的表达［15］，诱导细胞凋亡。本研究结果显示模型组Tsp-1 和Caspase-3 的表达显著上调，而电针能极显著降低TSP-1、Caspase-3 的mRNA 表达，提示电针能够抑制血管生成负性调节因子的表达，从而为血管的生成和稳定提供有利环境。万赛英等［16］研究也表明电针可以上调Ang-1 及下调TSP-1的表达，促进脑缺血区的血管的重建。余晓慧［17］等研究表明电针能通过抑制Caspase-3 在大鼠脊髓损伤神经元中表达，抑制神经细胞凋亡，减轻了脊髓继发性损伤，促进神经功能恢复。

脊髓压迫损伤后血管生成相关因子mRNA 表达异常，电针能够下调Ang-2、Tie-2、Tsp-1 和Caspase-3 的表达，从而使血管生成促进因子和抑制因子趋于正常水平，为受损脊髓组织修复提供有利条件。

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