心理应激致孕鼠乳腺发育不良及雌/孕激素和受体水平异常

王瑞琼，吴国泰，刘峰林，魏彦明* ，吴玉泓

(1. 甘肃农业大学，兰州 730070;2. 甘肃中医学院，甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州 730000)

随着集约化养殖业的发展，孕畜的生存生活环境完全处于非自然状态，孕期乳腺发育受环境因素的影响越来越明显［1－2］，许多外界不良因素的刺激可引起孕畜的心理应激反应，如受到惊吓和强烈刺激等，另外棚舍低矮、阳光不足、通风不良、活动受限、冷热刺激，强行驱赶、噪声、慢性疼痛等环境应激都可能引起孕畜的乳腺发育障碍。初产母畜因乳腺发育不良而致无乳症，给畜牧业的生产和效益造成严重的经济损失［3］。乳腺发育是动物泌乳性能的关键因素，而乳腺发育受“下丘脑－垂体－卵巢”神经内分泌轴的调控［4］，雌激素(E2)、孕激素(P)、生长激素(GH)、催乳素(PRL)及其受体水平能真实反映乳腺发育的程度和状态［5，6］，现代医学研究发现心理应激与乳腺增生或乳腺癌的发生不一定存在直接关系，但是心理应激能导致女性内分泌紊乱，引起雌激素、孕激素水平变化，导致围产期母体乳腺异常［7－9］。本研究基于环境异变引发心理应激，导致神经内分泌系统紊乱，进而阻碍乳腺发育的假说，研究怀孕大鼠乳腺发育与雌激素、孕激素及其受体水平变化的关系，探索规避伤害性刺激以期保护乳腺正常发育的科学方法，为相关研究和畜牧业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级Wistar 性成熟大鼠，由甘肃中医学院实验动物中心提供【SCXK(甘)2011－0001】，其中雌鼠30 只，体重200 ～250 g，80日龄;雄鼠15 只，体重250 ～300g，90日龄。在本中心无特定病原体(specific pathogenfree，SPF)实验室饲养【SYXK(甘)2011－0001】，SPF 级大鼠生长发育饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供;室温(20±2)℃，相对湿度(50±5)%，12 h 明暗交替，适应3d 后开始实验，实验过程中没有动物死亡及流产，本实验方案获得甘肃中医学院实验动物伦理委员会批准(批准号:20131015－02)。

1.1.2 药品与试剂

125I－E2、125I－PROG、125I－PRL 及125I－GH 放射免疫试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司，中国)，枸橼酸钠抗凝剂(四川绵竹鸿基制药有限责任公司，中国)，3H－雌二醇(3H－E2，放射比活度2.25TBq/mmol，New England Nuclear 公司)，3H－孕酮(3H－P，放射比活度150.1 GBq/mmol，New England Nuclear 公司)，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)。其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

培养倒立头显微镜(Nikon，日本);TGL20M 医用离心机(湖南凯达科学仪器有限公司，中国);高速冷冻离心机(Sigma，美国);HH－4 恒温水浴锅(金坛市丰仪器制造有限公司，中国);601－01 游标卡尺(哈尔滨量具刃具集团有限责任公司，中国);DT510H 超声波清洗器(Bandelin，德国);DW－86L338 医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司，中国);PAT－8 场景恐惧系统(成都泰盟科技有限公司，中国)，JA3003B 电子天平(上海越平科学仪器有限公司，中国);SN－659 型智能放免γ测量仪(上海应用物理所日环光电仪器有限公司，中国);高速组织匀浆机(IKA，德国);微量分光光度计(Thermo，美国);7220 紫外－可见光分光光度计(上海第三分析仪器厂，中国);LS 6500 液体闪烁计数仪(Beckman，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物筛选

实验前，30 只雌鼠行阴道脱落细胞涂片，HE 染色，连续观察2 个动情周期，选用有4 d 左右性周期的大鼠，将处于动情期的雌鼠与雄鼠(2∶1)于每日20:00 －22:00 随机合笼交配，次日晨8:00 观察阴栓情况，将发现阴栓且阴道涂片存在精子者确定为孕鼠，并定为妊娠的第1 天。

1.2.2 分组与造模

将20 只妊娠大鼠，随机分为对照组和实验组，每组10 只。实验前观察大鼠近尾端第2、3 对乳头的外观并用游标卡尺测量乳头直径及高度。对照组大鼠每笼5 只常规饲养(不给任何刺激)，实验组大鼠单笼孤养并施加5 种不可预见性应激刺激。5 种刺激15 d 内随机安排，每天1 种，每种刺激出现3 次且不连续出现。应激刺激操作方法:①噪音刺激:将大鼠置于PAT－8 场景恐惧系统中，选择强度为95 dB 的声音刺激5 min;②束缚应激:将大鼠置于固定器中(直径5.5 cm，管壁有直径为0.4 cm 的小孔)6 h，不挤压大鼠尾巴;③昼夜颠倒:早7:00 时将大鼠放入密闭暗室中，关灯使动物处于黑暗状态，晚7:00 时打开暗室照明灯(功率100 W 白炽灯)，使大鼠处于光照状态，次日早7:00 时取出;④冰水游泳:将大鼠置于盛有4℃水池中(水深30 cm)游泳10 min;⑤夹尾致痛:固定器固定大鼠，露出尾部，用止血钳夹住距尾尖1/3 处(使其发出叫声但不破皮)，持续30 min。

1.2.3 检测指标与方法

(1)乳头直径、高度、乳房系数

造模前后观察乳头外观并用游标卡尺测量近尾端第2、3 对乳头的直径及高度。造模第16 天，各组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，心脏取血2.0 mL 后，剥离近尾端第2、3 对乳头皮肤，置于冰盘上，用9 mm 打孔器摘取第2、3 对乳房组织，电子天平精密称重，计算乳房系数。乳房系数=乳房重量(g)/体重(100 g)。

(2)乳房DNA、RNA 含量检测

取第2 对右侧乳房组织，－70℃液氮冻存，待测DNA 和RNA。按文献［10］方法提取DNA 和RNA。7220紫外－可见光分光光度计在260 nm 处测量吸收度(A)，稀释前DNA、RNA 的浓度=A 值 × 稀释倍数 × 50 μL/mL(1 个A 值相当于50 μL/mL 的DNA 或RNA)，换算为100 g 组织所含DNA 或RNA 的量。

(3)血浆E2、P、GH 和PRL 含量检测

按照(1)中所取2.0 mL 血液加入0.5 mL 4.0%枸橼酸钠充分混匀，静置15 min，4℃低温离心(4000 r/min，15 min)，取血浆－20℃保存，按试剂盒说明书检测血浆E2、P、GH、PRL 水平。

(4)乳房组织匀浆E2、P、GH 和PRL 含量检测

取已冷冻的大鼠第3 对右侧乳腺组织，冷生理盐水漂洗除去血液，滤纸吸干水分，精密称重，组织匀浆机中加入冷生理盐水制成10 mg/mL 的组织匀浆，4℃，3000 r/min 离心15 min，取上清液，按试剂盒说明书检测乳腺组织E2、P、GH、PRL 水平。

(5)E2和P 受体水平

取已冷冻的大鼠第3 对左侧乳腺组织，采用放射配基结合分析法R(LBA)测定，参照文献［11，12］，用Lowry 法测定样本蛋白质浓度，胞质雌二醇和孕酮受体用加膜活性碳吸附法(DCC)测定，测定数据按Scatchard法作图，求得雌二醇、孕酮受体的解离常数(Kd)和最大结合容量Bmax，受体数目以fmol/mg 胞质蛋白质表示。

(6)乳腺组织形态检查

取大鼠近尾端第2 对左侧乳房组织，迅速用10%的中性甲醛磷酸缓冲液固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察组织形态变化，计算每张切片中乳腺小叶的数目、乳腺小叶平均腺泡数及每张切片中3 个最大腺泡腔的直径。

1.2.4 统计方法

2 结果

2.1 乳房性状变化

对照组大鼠腹部近尾端第2、3 对乳头体积较大，隆起较高，较坚实;实验组大鼠乳头体积较小，紧贴于皮肤，隆起较低，较松软。与对照组比较，实验组大鼠乳头直径和高度减小，乳房重量减轻，乳房系数减小，差异均有显著性(P ＜0.05，P ＜0.01)，见表1、2。

2.2 乳房DNA、RNA 含量及RNA/DNA 比值

实验组大鼠乳房组织DNA、RNA 以及RNA/DNA均明显减小，与对照组比较，差异均有显著性(P ＜0.05，P ＜0.01)，见表3。

2.3 血浆E2、P、GH 和PRL 含量

实验组大鼠血浆E2、P、GH 和PRL 的含量均显著降低，与对照组比较，差异均有显著性(P ＜0.05)，见表4。

2.4 乳房组织匀浆E2、P、GH 和PRL 含量

与对照组比较，实验组大鼠乳房组织匀浆E2和GH 的水平均显著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，实验组大鼠血浆P 和PRL 水平具呈现下降趋势，组间差异无显著性，见表5。

2.5 E2 受体和P 受体水平

与对照组比较，实验组大鼠乳房组织E2受体和P受体的Bmax 均明显降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，E2受体和P 受体的Kd 均明显增高(P ＜0.01)，见表6。

表1 孕鼠乳头高度及直径比较(±s，n=10，mm)Tab．1 Comparison of the diameter and height of rat breast nipples in different groups

表1 孕鼠乳头高度及直径比较(±s，n=10，mm)Tab．1 Comparison of the diameter and height of rat breast nipples in different groups

注:与对照组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups乳头高度Nipple height 乳头直径Nipple diameter第2 对Second pair第3 对Third pair第2 对Second pair第3 对Third pair对照组Control group 2.02±0.16 1.98±0.12 0.96±0.09 0.91±0.11实验组Test group 1.85±0.11* 1.62±0.14＊＊ 0.75±0.12＊＊ 0.79±0.08*

表2 孕鼠乳房重量及乳房系数比较(±s，n=10，g)Tab．2 Comparison of the rat breast weight and index in different group

表2 孕鼠乳房重量及乳房系数比较(±s，n=10，g)Tab．2 Comparison of the rat breast weight and index in different group

注:与对照组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups体重Body weight乳房重量Breast weight乳房系数Breast index对照组 Control group 273.82±21.12 4.43±0.21 16.18±2.16实验组 Test group 260.15±16.14 3.47±0.32＊＊ 13.34±2.92*

表3 孕鼠乳房DNA 和RNA 水平比较(±s，n=10)Tab．3 Comparison of the rat breast DNA and RNA in different groups

表3 孕鼠乳房DNA 和RNA 水平比较(±s，n=10)Tab．3 Comparison of the rat breast DNA and RNA in different groups

注:与对照组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups DNA(mg/100 g tissue)RNA(mg/100 g tissue)RNA/DNA ratio对照组 Control group 32.52±4.36 63.40±13.66 1.95±0.18实验组 Test group 27.19±5.61* 44.02±11.38＊＊ 1.62±0.26*

表4 孕鼠血浆E2、P、GH 和PRL 含量比较(±s，n=10)Tab．4 The level of E2，P，GH and PRL in the rat plasma in different groups

表4 孕鼠血浆E2、P、GH 和PRL 含量比较(±s，n=10)Tab．4 The level of E2，P，GH and PRL in the rat plasma in different groups

注:与对照组相比，* P ＜0.05。Note. Compared with the control group，* P ＜0.05.

组别 Groups E2/pg/mg P/ng/mg GH/ng/mg PRL/mU/g对照组 Control group 19.77±4.98 8.23±2.32 9.49±2.15 14.08±2.73实验组 Test group 15.25±3.55* 6.04±1.26* 7.11±2.52* 11.85±3.03*

表5 孕鼠乳房组织E2、P、GH 和PRL 含量比较(±s，n=10)Tab．5 The levels of E2，P，GH and PRL in breast tissue homogenates in the rats of different groups

表5 孕鼠乳房组织E2、P、GH 和PRL 含量比较(±s，n=10)Tab．5 The levels of E2，P，GH and PRL in breast tissue homogenates in the rats of different groups

注:与对照组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别 Groups E2/pg/mg P/ng/mg GH/ng/mg PRL/mU/g对照组 Control group 7.43±2.46 3.63±0.94 16.28±3.23 8.12±2.64实验组 Test group 5.40±1.28＊＊ 2.98±1.01 12.80±4.88*6.90±3.20

表6 孕鼠雌二醇和孕酮受体水平比较(±s，n=10)Tab．6 The levels of E2 or P receptors in the pregnant rats of different groups

表6 孕鼠雌二醇和孕酮受体水平比较(±s，n=10)Tab．6 The levels of E2 or P receptors in the pregnant rats of different groups

注:与对照组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups E2 receptor P receptor Bmax(fmol/mg protein)Kd(×10－12，mol/L)Bmax(fmol/mg protein)Kd(×10－12，mol/L)对照组Control group 18.16±2.57 0.61±0.25 45.60±6.24 1.16±0.19实验组Test group 15.20±3.68＊＊ 2.12±1.34＊＊ 38.29±5.52* 1.62±0.36＊＊

2.6 乳腺组织形态学变化

对照组大鼠乳腺呈小叶分布，小叶较大、数量较多;腺泡周围及小叶间结缔组织较少，血管丰富;可见到数量较多的乳腺导管与腺泡结构，导管较粗较长且分支均匀分布到整个乳腺区。腺泡呈圆形或椭圆形，大小不一，腺泡数量较多且体积较大，腺泡充盈且有大量分泌物，上皮细胞呈低立方柱状，排列整齐，胞质空亮，可见圆形细胞核;实验组大鼠乳腺脂肪和结缔组织较多，乳腺小叶结构较少，导管和腺泡结构亦较少;导管较细较短且分支较少，腺泡数量较少，管腔萎缩甚至闭塞、上皮细胞扁平甚至消失，周围反应性间质减少、致密。见图1。实验组乳腺小叶数目、乳腺小叶平均腺泡数、最大腺泡腔/小叶的直径均低于对照组，差异均具有统计学意义(P ＜0.05，P ＜0.01)，见表7。

图1 乳腺组织形态观察(A.对照组;B.实验组。H－E 染色)Fig．1 Mammary gland sections tissue in rats of normal control (A)and model (B)groups. H－E staining

表7 乳腺小叶数目、乳腺小叶平均腺泡数和腺泡直径比较(±s，n=10)Tab．7 The number of lobules，gland acini and acinus diameter in the rats of different groups

表7 乳腺小叶数目、乳腺小叶平均腺泡数和腺泡直径比较(±s，n=10)Tab．7 The number of lobules，gland acini and acinus diameter in the rats of different groups

注:与对照组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别Groups乳腺小叶数目Lobule number乳腺小叶平均腺泡数Number of glandular cells腺泡直径/μm Acinus diameter对照组Control group 55.23±6.30 61.23±11.36 509.48±141.25实验组Test group 46.46±5.12＊＊ 48.43±7.74* 361.59±97.63*

3 讨论

动物乳房发育受内分泌系统及神经系统的调控，并随年龄、发情周期、生理状态呈动态变化，且妊娠期是家畜乳腺主要的生长阶段，到妊娠晚期或泌乳早期乳房才达到完全发育状态［14，15］。本研究根据动物乳腺发育及其生理活动特点，选择妊娠大鼠为研究对象，能短期集中反映乳腺发育的关键阶段，虽哺乳期动物乳腺发育持续进行，但是其组织形态已基本稳定［13］。在动物乳腺发育过程中，除了营养因素外，环境不适引发心理应激是导致乳房发育不良的主要原因之一［2］。本研究根据家畜在饲养管理及运输过程中存在的不良刺激因素，设计5 种刺激因素诱导心理应激的发生。根据养殖场外围的噪声污染，采用场景恐惧系统输出噪音刺激，干扰大鼠生物反应;依据规模化集约式养殖的特点，设置束缚应激激发大鼠神经内分泌紊乱，影响其生长发育;模拟自然生存状态，采用昼夜颠倒翻转大鼠的生物节律，影响自然生存状态;采用冰水游泳的方法实现冷应激刺激同时模拟强制驱赶，与束缚应激形成落差，导致大鼠体能、情志异常，出现抑郁甚至绝望;采用夹尾致痛的方法实现慢性疼痛和肢体不适带来的影响;综合以上5 种伤害性刺激，根据随机、均衡的原则安排刺激因素，实现了不可预见性刺激反应，也体现了一定的交互作用或叠加作用，基本能真实反应环境异常导致的最常见心理应激，不足之处在于大鼠的孕期为19 ～22d，应激反应持续时间较短，如果选用孕期较长的动物可能会有新的发现。

本研究发现，心理应激影响大鼠的体重增长，可能与饲料的摄入不足或者胃肠功能紊乱有关，但差异在15 天内无统计学意义;孕鼠乳头大小、乳房重量及系数的变化均能反映乳腺发育的大体性状，研究结果显示心理应激能阻碍乳房生长，预期对产后泌乳性能会带来不良结果。前期研究表明大鼠乳腺重量和DNA、RNA 含量显著提高能促进乳腺发育［10－14］，本研究发现应激刺激使孕鼠乳房重量、乳房组织DNA、RNA、RNA/DNA 水平均明显降低，与前期研究结果相符。

心理应激主要通过下丘脑－垂体－肾上腺轴而影响神经－内分泌－免疫网络，内分泌系统的紊乱是影响乳腺发育的重要原因［15－17］。E2能促进乳腺导管的发育、刺激上皮增生、导管及小叶周围结缔组织的发育，P 能促进腺小叶及腺泡的发育，GH 有利于导管和小叶腺泡生长，PRL 诱导腺小叶的分化，各种激素相互协同，调节乳腺发育［18－20］。E2、PRL 与GH 的协同作用可能是促进孕期乳房发育的重要因素。本研究中发现应激孕鼠乳腺组织PRL 水平具有下降的趋势，但差异无统计学意义，可能与围产期的不同时间有关。在受体方面，Kd是反映受体与配体结合的亲和力的参数，Kd 值越小，表示激素与受体结合的亲和力越大。应激孕鼠E2受体和P 受体的Kd 均显著增高，说明E2和P 与其受体的的亲和力降低，不利于E2和P 发挥正常的生理功能。本研究发现给予妊娠大鼠应激刺激后，其乳腺组织形态发生了明显的变化，脂肪和结缔组织增多，小叶数目以及腺泡与导管的数量、体积均减少，说明应激刺激后，乳房组织结构呈现出发育不良现象。

本研究结果为畜牧业生产中规避伤害性刺激导致心理应激影响孕畜乳腺正常发育而致缺乳提供了实验依据，也为复制乳腺发育不良大鼠模型，开展促进乳腺发育、增强泌乳性能相关研究提供了方法参考。

［1］宋传德. 浅谈家畜的七情致病［J］. 吉林畜牧兽医，2002，(4):33－34.

［2］张典. 论家畜的情志［J］. 中兽医学杂志，1982，(2):3－6.

［3］蓝荣庚. 规模化猪场母猪的乳腺发育值得关注(下)［J］. 今日养猪业，2014，(4):15－17.

［4］王月影，王艳玲，李和平，等. 动物乳腺发育的调控［J］.畜牧与兽医，2002，34(7):36－38.

［5］赵国丽，宫艳斌，韩元，等. 激素和生长因子调控奶牛乳腺发育的研究进展［J］. 中国奶牛，2011，6(6):25－30.

［6］江青东. 大鼠乳腺发育过程中雌激素、孕激素、催乳素及相应受体水平变化规律的研究［D］. 河南农业大学，2006.

［7］Schraub S，Sancho－Garnier H，Velten M. Should psychological events be considered cancer risk factors?［J］. Revue d′Epidemiologie et de Sante Publique，2009，57(2):e7－e16

［8］Backeljauw PF，Dattani MT，Pinchas Cohen P，et al. Disroders of growth hormome/insulin－like growth factor secretion and action［M］.In:Sperling MA (Ed.):Pediatric Endocrinology (Fourth edition)，Chapter 10. 2014，291－404

［9］Henning JD，Jenkins FJ，Bovbjerg DH. Psychological stressors significantly speed the development of primary mammary tumors in the HER－2/neu mouse transgenic breast cancer model［C］. the 21st Annual PNIRS Meeting，2014，e1－e52. Brain Behavior Immunity，2014，Suppl:e35

［10］张荣庆，韩正康，陈杰，等. 大豆黄酮对大鼠乳腺发育作用的实验研究［J］.动物学报，1995，41 (3):332－338.

［11］王伟群，韩正康，陈伟华，等. 芒柄花素的促乳腺发育作用及机理探讨［J］. 南京农业大学学报，1993，16(增刊):19－24.

［12］彭珊珑，欧阳雪宇，王文杰. 小鼠腹腔巨噬细胞PAF 受体放射配基受体结合分析方法［J］. 中国药理学通报，2004，20 (5):585－587.

［13］李健. 乳腺发育的内分泌调控［J］. 国外兽医学－畜禽疾病，1996，1(1):9－12.

［14］张荣庆，韩正康，陈杰，等. 大豆黄酮促进妊娠大鼠乳腺发育和泌乳的实验研究［J］.动物学报，1995，41(4):414－417.

［15］敖海清，徐志伟，严灿. 心理应激相关疾病的研究探要［J］. 中医药学刊，2004，22(8):1414－1415.

［16］王建红，王敏璋，伍庆华，等. 心理应激大鼠卵巢内分泌功能降低模型的实验研究［J］. 中国实验动物学杂志，2002，12(4):13－15.

［17］柯江维，王建红，段荣. 心理应激雌性大鼠海马－下丘脑－垂体雌激素受体的变化［J］. 中国病理生理杂志，2006，22(1):98 －101.

［18］Akers RM. Major advances associated with hormone and growth factor regulation of mammary growth and lactation in dairy cows ［J］. J Dairy Sci. 2006，89:1222－1234.

［19］Connor EE，Meyer MJ，Li RW，et al. Regulation of gene expression in the bovine mammary gland by ovarian steroids［J］. J Dairy Sci，2007，90(Suppl－1):55－65.

［20］俞熔. 女性亚健康与肝的关系研究［D］. 中国中医科学院，2013.