电针对脑缺血/再灌注模型大鼠双侧脑区IL-1β、ICAM-1表达的影响

宋映周，孙琳琳，任暎贞，张旭辉，许明敏，于淼，郭郁，图娅

(1．北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029;2．北京首钢医院，北京 100028)

脑血管病是人类健康大敌，当前威胁人类健康的三大疾患之一，具有发病率高、死亡率高、致残率高等特点。脑缺血炎性反应是缺血性脑损害的重要病理机制之一。脑缺血后级联式炎性反应是一个复杂的动态过程。缺血后机体处于应激状态，在缺血损伤区各种炎性因子表达增加，包括细胞因子和细胞间粘附分子。针刺对脑缺血性疾病具有良好干预作用［1］，且这种干预作用贯穿于脑缺血性疾病的急性期、损伤期及恢复期。研究发现针刺百会、足三里穴对神经、内分泌-免疫调节网络具有良性调节作用，可抑制脑缺血/再灌注区的炎性反应，促进脑梗死区的神经功能恢复［2］。本实验通过对比观察不同时间大鼠健、患侧脑区IL-1β 和ICAM-1 的表达情况，进一步探讨针刺干预脑缺血性疾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、分组和处理

SPF 级SD 大鼠，雄性，体重(275±15)g，动物来源于中国食品药品检定研究院实验动物资源中心【SCXK(京)2009-0017】。实验在中国医学科学院基础医学研究所进行【SYXK(京)2010-0021】，并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。将大鼠按随机数字表分成空白组(10 只)和造模组，造模成功(根据神经功能评分)的大鼠再随机分为模型组和针刺组，模型组和针刺组又分为12、24、48、72、96 h 和144 h 六个时程，每个时程10 只。时程的计算方法:起点为拔栓实现再灌注时间，终止点为取材时间，之间时长为各时程。空白组不做任何处理;模型组造模成功后，于每日针刺组治疗时给予抓取刺激一次;针刺组电针刺激大鼠头部百会和足三里(患侧)，采用疏密波，频率2 ～100 Hz，强度2 mA，每次20 min，每日1 次，首次治疗于拔栓后30 min，末次治疗为灌注取材前150 min。

1.2 试剂和仪器

兔抗大鼠IL-1β IgG(Santa Cruz Biotechnology，批号:G2110)，山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号:V0602)，山羊抗鼠ICAM-1 IgG(R＆D system 公司，批号:EWL0109111)，生物素标记的兔抗山羊IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号:W0524)，辣根酶标记亲和素-HRP 连接物(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号:V0723)，DAB 显色试剂盒(北京西雅金桥生物技术有限公司)，大鼠MCAO 栓线-2432、2634、2636，4A 级(北京沙东生物技术有限公司)，华佗牌无菌针灸针0.30×25 mm(苏州医疗用品厂有限公司)，长城牌KWD-808Ⅱ全能脉冲电针仪(常州市武进长城医疗器械有限公司)，显微镜(日本Olympus 公司)。

1.3 脑缺血/再灌注损伤模型制备和神经功能评分

参照改良的Zea Longa 方法［3］制备脑缺血/再灌注损伤大鼠模型。大鼠10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧固定，取颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎并切断ECA 后，由ECA 残端沿ICA 缓慢插入栓线，此时栓线完全阻塞大脑中动脉入口。缺血后2 h 进行再灌注，麻醉动物，缓慢轻拉栓线，大鼠清醒后自由进食水和食物。

参照改良的Bederson 5 级评分法［4］。0 级(计0分):无功能缺损;1 级(计1 分):不能完全伸展左前肢;2 级(计2 分):左前肢屈曲，向左侧推动时阻力下降;3级(计3 分):爬行时向左侧转圈;4 级:不能自发行走，意识丧失，包括24 h 内死亡;剔除评级为0 级和4 级的大鼠。

1.4 指标检测与方法

免疫组化法检测双侧脑组织中IL-1β 和ICAM-1含量。用10%水合氯醛麻醉大鼠，切开胸腔，充分暴露心脏，依次用生理盐水和4%多聚甲醛灌注300 ～400 mL，取脑组织置于4%多聚甲醛中，4℃保存。切取视交叉前后2 ～3 mm 的脑组织截面，制备冰冻切片。检测时采用枸橼酸修复液，微波炉中微波热修复10 ～15 min，用PBS 冲洗2 次，加一抗(兔抗大鼠IL-1β，山羊抗大鼠ICAM-1)室温孵育48 h;PBS 冲洗3 次，加二抗，室温孵育2 h;加生物素-酶，室温孵育30 min;PBS冲洗3 次，DAB 显色，中性树胶封固，二甲苯擦拭玻片。

1.5 数据的读取与分析

在光学显微镜下对标本的健侧和患侧皮质、纹状体相关脑区进行分析和图像采集，分别观察相关脑区IL-1β、ICAM-1 的表达情况，使用医学图像分析软件进行图像密度比对，检测积分光度值(integrated optical density，IOD)。

1.6 统计学处理

使用SPSS 17.0 软件进行数据分析，数据用均数±标准差(±s)表示。服从正态分布，方差齐时，各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA);服从正态分布，方差不齐，采用t 检验;不服从正态分布，采用非参数检验。以α=0.05 作为检验标准。

2 结果

2.1 神经功能评分

正常组大鼠无神经功能缺损表现，模型组(在模型制备过程中死亡率为28.8%)大鼠随着存活时间的延续，神经功能评分有降低趋势，96、144 h 的评分与造模后比较有极显著性差异(P ＜0.01)。

表1 模型组大鼠各时程造模后与取材前神经功能评分比较Tab．1 Comparison of the neurofunctional scores of the rats in the model group during the time course after modeling

2.2 各组大鼠脑组织IL-1β 变化趋势比较

脑缺血/再灌注损伤后，模型组健、患侧脑组织IL-1β 表达均高于正常组，且呈典型双峰模式。健侧在12 h 到达第一峰峰值，至48 h 小幅下降后又持续增高，在144 h 到达第二峰峰值;患侧在48 h 到达第二峰峰值，72 h 短暂下降后又持续增高。48 h 时，患侧明显高于健侧(P ＜0.05)，而96、144 h 时IL-1β 表达又明显低于健侧(P ＜0.05)。针刺组健、患侧脑组织的IL-1β 均在24 h 到达第一峰峰值，之后迅速下降，至144 h 到达第二峰峰值，但患侧的第一峰峰值和第二峰峰值均低于健侧(P ＜0.05)。除第24 h，针刺组健侧高于模型组健侧(P ＜0.05)，其余时间点均低于模型组健侧(P ＜0.05);针刺组患侧在各时间点的IL-1β 表达均显著低于模型组患侧(P ＜0.05)。见表2，见图1。

表2 各组大鼠健、患侧脑组织中IL-1β 的IOD 值比较(±s，n=10)Tab．2 Comparison of the IL-1β values between bilateral brain tissues of the rats in in each group

表2 各组大鼠健、患侧脑组织中IL-1β 的IOD 值比较(±s，n=10)Tab．2 Comparison of the IL-1β values between bilateral brain tissues of the rats in in each group

注:#:与空白组比较P ＜0.05;△:与模型组健侧比较P ＜0.05;▲:与模型组患侧比较P ＜0.05，□:与针刺组健侧比较P ＜0.05。Note．# P ＜0.05，vs．control group;△P ＜0.05，vs．model group healthy side;▲P ＜0.05，vs．model group affected side;□P ＜0.05，vs．acupunture group healthy side．

组别Groups 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h空白组Control group 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72 158268.03±31433.72模型组健侧Model group healthy side 319807.71±97115.86#263859.30±18863.82#240213.46±108386.47#338739.89±130629.53#418094.09±82264.77#470523.51±32894.01#患侧Model group affected side 279250.51±65430.68#284544.8±77287.66#340476.88±84865.46#△270354.62±24252.11#323688.62±71031.85#△391050.44±95572.07#△针刺组健侧Acupunture group healthy side 239633.38±40715.95△398421.28±45902.22△256400.21±71303.38 233507.35±55078.68△219471.50±98511.13△260347.54±50688.53△患侧Acupunture group affected side 191513.48±32696.92▲200794.00±66092.71▲□166092.71±35070.34▲□183753.24±64289.76▲192891.96±58550.56▲209295.24±29807.97▲□

图1 不同时间点大鼠患侧脑组织IL-1β 免疫组化图(×100)Fig．1 Expression of IL-1β in affected side brain tissues at different time points in the rats of each group．Immunohistochemical staining，×100．

2.3 各组大鼠脑组织ICAM-1 变化趋势比较

脑缺血/再灌注损伤后，模型组健、患侧脑组织ICAM-1 表达均呈现双峰模式，在24 h 到达第一峰峰值，之后迅速下降，至72 h 又呈上升趋势，在144 h 时达到第二峰峰值。模型组健、患侧的两个峰值均高于正常组(P ＜0.05)，且在48 h 时，患侧的ICAM-1 表达高于健侧(P ＜0.05)。针刺组健、患侧脑组织ICAM-1 表达也均呈现双峰模式，在24 h 到达第一峰峰值，之后持续下降，分别在144 h 和96 h呈上升趋势，并在144 h 到达第二峰峰值。除第96 h，针刺组健侧ICAM-1 表达均高于针刺组患侧(P ＜0.05)。针刺组健侧在12、24 和48 h 的ICAM-1 表达均高于模型组健侧(P ＜0.05)。针刺组患侧在12、24、48 h 的ICAM-1 表达均高于模型组患侧(P ＜0.05)，在144 h 时低于模型组患侧(P ＜0.05)。见表3，见图2。

表3 各组大鼠健、患侧脑组织中ICAM-1 的IOD 值比较(±s，n=10)Tab．3 Comparison of IOD values of ICAM-1 between bilateral brain tissue in the rats of each group

表3 各组大鼠健、患侧脑组织中ICAM-1 的IOD 值比较(±s，n=10)Tab．3 Comparison of IOD values of ICAM-1 between bilateral brain tissue in the rats of each group

注:#:与空白组比较P ＜0.05，△:与模型组健侧比较P ＜0.05，▲:与模型组患侧比较P ＜0.05，□:与针刺组健侧比较P ＜0.05。Note．#P ＜0.05，vs．the control group;△P ＜0.05，vs．the model group healthy side;▲P ＜0.05，vs．the model group affected side;□P ＜0.05，vs．acupunture group healthy side．

组别Groups 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h空白组Control group 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74 162304.14±38542.74模型组健侧Model group healthy side 159509.92±37488.98#288824.99±85352.68#147767.39±34214.72 181026.82±64548.24#273672.49±173401.83#307281.12±125453.66#患侧Model group affected side 162049.45±38542.74 248977.65±18853.59#155241.03±74295.91△202082.30±61369.86#203827.80±55309.95 335731.39±34122.78#针刺组健侧Acupunture group healthy side 402705.87±183392.23△496248.81±59003.44△347462.70±60274.80△275956.55±111158.30 272454.16±105007.53△426407.09±24300.12患侧Acupunture group affected side 234326.77±44547.28▲□287853.74±65379.62▲□234156.08±8424.30▲□207482.43±82936.51□218252.23±94233.61 301480.25±40683.47▲□

3 讨论

缺血性脑中风是常见的中风类型，其发生率约占中风总人数的60% ～80%［5］。对其损伤与修复机制的研究发现炎症反应是造成脑缺血/再灌注损伤的主要原因之一［6－7］。早期给予溶栓、抗凝治疗可有效降低再灌注损伤，但这种治疗存在严格的时间窗限制，对于长期中风患者的恢复作用不显著。近年来，大量研究表明针刺对脑缺血性疾病有良好的干预作用。本实验选取百会和足三里(患侧)对脑缺血/再灌注损伤模型大鼠进行干预。其中百会为督脉穴，督脉循行于脊里，入络脑，与脑和脊髓都有密切联系，针刺百会可以促进脑神经细胞修复。足三里为足阳明胃经合穴，阳明经为多气多血之经，手足阳明经行于四肢外侧，汇聚于头部，刺激阳明经穴可以通调气血，改善肢体功能障碍，调节大脑皮质运动中枢。有研究认为针刺百会、足三里穴能减轻缺血时脑功能损伤，通过抑制脑缺血/再灌注区的炎性反应，降低ICAM-1 表达，促进缺血区脑神经功能恢复［2］。

IL-1β 主要由神经元、血管内皮细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞产生。脑缺血再灌注后，IL-1β蛋白含量显著增多，其主要原因是缺血后再灌注可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，分泌大量IL-1β，促使白细胞向缺血区浸润，导致神经元坏死［8］［9］［10］。ICAM-1 为免疫球蛋白超家族成员，主要表达于神经元细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、上皮细胞和神经胶质细胞，是重要的白细胞-内皮细胞间黏附分子之一，参与细胞间、细胞与基质间的信号交换，介导细胞黏附、识别、活化、增殖、分化、炎性反应，以及损伤修复等多种病理生理功能［11］。脑缺血损伤后，炎性细胞因子IL-1β 可激活胞内信号通路，使ICAM-1 在血管内皮细胞表达增高。在黏附分子介导下白细胞与内皮细胞相互作用，白细胞变形移出血管并浸润到脑组织，导致继发性神经元死亡和梗死面积扩大［12］。

脑缺血/再灌注损伤初期(48 h 内)，由炎性细胞分泌的炎性因子具有神经毒性作用，其持续时间越长、表达越多，应激损伤程度越强［13－14］。脑缺血/再灌注损伤中后期(72 －144 h)，主要由胶质细胞分泌炎性细胞因子，该细胞因子具有神经保护作用，可刺激机体启动神经损伤修复功能，促进神经元存活及组织再生［15－16］。本实验中正常组大鼠脑区的IL-1β 和ICAM-1 均少量表达，主要来源于神经元细胞，与文献报道一致［17－18］。模型组大鼠患侧脑区的IL-1β 和ICAM-1 表达均呈现典型的双峰模式。脑缺血早期，强烈的应激及损伤反应导致炎性细胞因子表达增高。脑缺血中后期，随着炎性反应的抑制及修复功能的启动而表达降低。针刺百会和足三里穴后，早期患侧脑区IL-1β 的表达水平显著降低，炎性反应得到抑制。中后期，炎性因子增多，表达时间提前，可激活损伤-修复网络调节系统，促进损伤区神经细胞修复。ICAM-1 在损伤修复早期和中后期表达水平均显著增高，表明针刺可活化胶质细胞，增强细胞间联系，促进细胞增殖分化，恢复神经元功能。

图2 不同时间点大鼠患侧脑组织ICAM-1 免疫组化图(×100)Fig．2 Expression of ICAM-1 in the affected side brain tissues at different time points in the rats of each group．Immunohistochemical staining，×100．

模型组患侧脑区IL-1β 在缺血再灌注早期表达高于健侧，在中后期低于健侧，提示早期的细胞损伤与IL-1β 表达增高有关，中后期健侧脑组织通过启动内源性保护机制，产生缺氧耐受，从而减缓了缺血区的细胞损伤。健、患侧脑组织中ICAM-1 表达趋势相似，提示健侧脑组织在应激-损伤过程中可能发挥了协同替代作用。针刺组患侧脑区IL-1β 和ICAM-1 的表达水平低于健侧，表明电针可以抑制缺血区的炎症反应，并活化了健侧脑区相关的细胞信号。

本研究结果表明针刺可影响双侧脑组织中IL-1β 和ICAM-1 的表达，且患侧表达水平均低于健侧，提示针刺百会配伍足三里穴对脑缺血后机体产生的应激-损伤-修复信号链发挥了网络调节作用，针刺可通过降低患侧脑组织IL-1β 和ICAM-1 的表达，抑制炎症反应，改善脑缺血再灌注损伤，这可能是针刺治疗脑缺血性疾病的机制之一。

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