恒河猴P21基因在COS-7细胞中沉默位点的验证

李雨函，苏静芬，张晨，石亮，刘云波

(1．中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021;2．北京大学生命科学学院，北京 100871)

与目前广泛使用的啮齿动物相比，非人灵长类动物在生理、发育、行为、免疫以及基因背景与人类更加相近。在药物研发和安全性评价中，为减少啮齿动物与人类基因背景的差距所带来的不稳定性和局限性，非人灵长类已成为重要的肿瘤研究和药物评价的实验动物［1］。

虽然一直有非人灵长类自发神经、消化道等肿瘤的报道，但因发生率较低难以用其自发肿瘤作为研究模型［2］。此外，在研究中由于非人灵长类动物个体间基因背景差异明显，对统计的分析要求较复杂，明显的个体基因差异也影响研究结果的分析和解释。因此，利用癌症相关基因和基因工程技术建立和发展非人灵长类肿瘤模型动物为癌症机制的研究和抗癌药物研发以及临床前实验服务具有重要意义［3］。

P21Waf1/Cip1/Sdi1(文中简称P21)是细胞周期素依赖性激酶抑制因子，属于CIP 家族。P21 具有广泛的CDK 抑制活性，因其作用于细胞周期减少受损DNA 的复制和积累，发挥抑癌作用，长期以来被认为具有抑制肿瘤的功能。近些年对P21 的研究发现在Trp53－/－和Atm－/－小鼠自发性淋巴瘤中P21 并没有抑制肿瘤的发生，因此有提出在特定的细胞环境和条件下P21 有可能是致癌基因［4，5］。P21 在癌症发生和发展中的功能非常重要，而其作用并不完全清楚。为利于以后建立相应基因沉默动物模型、深入研究P21 在肿瘤发生及发展中的作用和功能，本研究从细胞水平筛选并确定了恒河猴P21 基因的沉默靶点，为进一步探讨P21 的功能作用奠定细胞水平的基础研究。

1 材料和方法

1.1 材料

COS-7 购自中国医学科学院基础研究所细胞中心，Vero，Vero-E6 购自ATCC 细胞库。含有ubiquitin promoter (Ubi promoter)调控的红色荧光蛋白tandem dimer tomato(tdt)报告基因的FUGW-TDT 慢病毒载体由北京大学实验室保存。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶为Invitrogen-Gibco 公司产品。细胞培养基DMEM 购自Hyclone;质粒提取试剂盒购自Promega;逆转录试剂盒购自Invitrogen;PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司;E．coli DH5α 感受态细胞购自全式金公司;鼠抗猴P21 单克隆抗体，购自Santa Cruz公司;HRP 标记的羊抗鼠-HRP 购自Sigma;PCR 检测引合成及测序均由Invitrogen 公司提供;β-actin抗体购自上海康成生物;Xho I 和Xba I 购自NEB。

1.2 shRNA 的设计

Life technology 在线shRNA 设计工具，根据NCBI 数据库中恒河猴 P21 基因的序列(NM _00194722.2)，依照shRNA 设计原则，选择五个靶点设计shRNA 序列(序列见表1)。靶点均与非洲绿猴P21 基因同源。设计网址为(http://rnaidesigner．lifetechnologies．com/rnaiexpress/setOption．do?designOption=shrna＆pid=261946071111563135)。

1.3 P21-RNA 干扰慢病毒载体的构建和鉴定

载体构建参考文献［6］。用Xho I 和Xba I 对FUGW-TDT 载体进行酶切消化，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收、纯化后备用。载体与需要导入的shRNA 按比例混合16℃过夜连接后转化至E．coli DH5α 中，37℃培养后挑取单菌落培养后进行 菌 液鉴 定 及测序(引物均为F:5’-AGGAAGATGGCTGTGAGG-3’;R:5’-GCCTTGTATCGTATAAGC-3’，提取阳性克隆菌液质粒，命名为 FUGW-TDTP21shRNA。本实验的阴性对照为未导入shRNA 的空载FUGW-TDT 空质粒。

1.4 细胞培养与慢病毒质粒转染

用含有10% 胎牛血清的DMEM 培养液在37℃，5% CO2培养箱中常规培养上述细胞。在六孔板中按每孔(6 ～8)×105细胞种细胞，24 h 内细胞密度达70% ～80%时进行转染。实验分空载质粒组(阴性对照)和FUGW-TDT-shP21 质粒组。其中质粒组分别为四个针对不同靶点设计的质粒。转染按照Polyethylenimine (PEI)试剂说明操作，48 h后观察荧光。

1.5 RT-PCR 检测各组细胞中mRNA 的表达

收集各组细胞按照Invitrogen Trizol Reagent 说明书分别提取细胞总RNA，测量其浓度后按试剂盒说明进行逆转录和PCR。P21 基因引物为F:5’-CGAAGTCAGTTCCTTGTGGG-3 ’， R: 5 ’-CATTAGCGCATCACAGTCGC-3’预计扩增出188 bp 左右的目的片段。内参GAPDH，其引物序列参考文献［7］，F:5’- ACATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，R:5’AGTGGGTGTCGCTTTGAAGTC-3’，预计扩增出261 bp 左右的目的片段。PCR 反应程序:94℃预变性2 min，95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环，72℃延伸10 min。

1.6 Western blot 检测各组细胞中P21 蛋白的表达

转染细胞48 h 后弃掉细胞培养液、吸净残液，加入预冷的1 × PBS 冲洗两次后加入1 × SDS 裂解液，均匀吹打细胞后收集裂解产物，高速离心后收取上清测定总蛋白浓度。SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳用8% 的分离胶以及4%的积层胶，总蛋白上样量为20 μg。转膜后加鼠抗猴P21 单克隆抗体(1∶1000)封闭液4℃孵育过夜，1 × PBS 充分洗膜后加入HRP 标记的羊抗鼠IgG(1∶5000)封闭液孵育3 h，曝光、显影后用Image J 软件进行灰度扫描分析。

1.7 统计分析

进行方差齐性检验后采用Fisher 检验，P ＜0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 恒河猴P21 基因沉默靶点和shRNA

Life technology 在线设计shRNA 序列，在恒河猴P21mRNA 中的位置见表1。

表1 恒河猴P21 基因沉默靶点Tab．1 The sites of P21 gene silencing in the rhesus monkeys

2.2 细胞中P21 丰度的检测

选取Vero、Vero-E6、COS-7 三种细胞提取RNA后逆转录为cDNA，普通PCR 后电泳检测P21 丰度(图1)。结果显示三种细胞P21 的丰度均较高，但实验中COS-7 比Vero、Vero-E6 更易转染，因此本研究室优先选取COS-7 用于基因抑制效率检测。

图1 P21 细胞丰度检测Fig．1 Detection of the P21 abundance

2.3 检测转染细胞中P21 基因mRNA 的表达

转染48 h 后提取RNA，RT-PCR 检测P21 mRNA 在COS-7 细胞中的表达，trizol 法提取RNA，逆转录后进行real-time PCR，按2-ΔΔCt法进行计算。与空载 FUGW-TDT 质粒相比，四个靶位点在P21mRNA 水平的沉默效率均明显(P ＜0. 05)，其中FUGW-TDT-P21shRNA-1 的沉默效率为(91.82±3.21)%，FUGW-TDT-P21shRNA-2 的沉默效率为(82.47±2.48)%，FUGW-TDT-P21shRNA-3 的沉默效率为(81.31±2.69)%，FUGW-TDT-P21shRNA-4的沉默效率为(87.35±4.59)%(图2)。

图2 SYBR-Green 法real-time PCR 检测P21 基因mRNA 的表达Fig．2 Detection of P21mRNA by real-time PCR

2.4 FUGW-TDT shRNA 对cos-7 细胞中P21 蛋白表达的抑制作用

Western blot 检测COS-7 细胞中P21 的表达量，结果显示P21 shRNA 转染的细胞P21 蛋白的表达量较对照组明显减少。经图像软件进行灰度分析，其中FUGW-TDT-P21shRNA-1 转染后细胞P21 表达量为(11.97±0.70)%，FUGW-TDT-P21shRNA-2 转染后细胞P21 表达量为(20.22±0.65)%，FUGWTDT-P21shRNA-3 转染后细胞P21 表达量为(23.21± 0.63)%，FUGW-TDT-P21shRNA-4 转染后细胞P21 表达量为(14.42± 0.86)% (图3)。Western blot 显示的结果和real-time PCR 保持一致，四个靶位点在P21 蛋白水平的沉默效率明显。

图3 Western Blot 检测COS-7 细胞中P21 蛋白的表达量Fig．3 Detection of P21 protein by Western blot．

3 讨论

在CDKN1A－/－小鼠发生自发性肿瘤是P21 首次从基因学证明其具有抑癌作用，虽然人类的直肠癌、宫颈癌、脑颈部癌症、肺癌等大多数癌症的发展都与P21 的表达相关，但并没有证明CDKN1A 的变异使P21 的功能完全丧失，但可以说明P21 在抑癌作用中发挥着重要作用，和其他一些抑癌因子共同调节抑制肿瘤发生和恶化［8］。P21 与肿瘤 的分化、浸润深度、增生和转移有关，具有判断预后的价值。

现有研究发现在特定条件下P21 的错误调控和表达也会致癌。在人类前列腺癌、乳腺癌、鳞状细胞癌都有P21 过量表达，虽然没有直接证据证明P21 过量表达与癌症直接相关，或是此类发现有可能是受到化疗和放疗的影响，但P21 是致癌基因的理论在少量基因小鼠的研究中已被发现［4，9］。

本研究中real time PCR 和Western blot 分析RNA 干扰的COS-7 细胞中P21 mRNA 水平和蛋白表达量均比对照组显著降低，且二者结果一致，有助于建立P21 沉默的恒河猴模型。

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