胰腺癌特异相关长链非编码RNA靶基因的筛选验证及分析**



胰腺癌特异相关长链非编码RNA靶基因的筛选验证及分析**

徐胜前秦勇叶冠雄吴成军王世潘德标

温州医科大学附属第六医院丽水市人民医院肝胆胰外科,浙江省丽水市323000

长链非编码RNA(1ncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA，其本身不编码蛋白，而是以多种形式调控基因的表达[1]；它不仅在表观遗传学修饰、转录与转录后调控、维持正常组织的发育和分化中发挥重要作用，而且通过调控细胞周期与凋亡影响肿瘤细胞的生长、迁移与侵袭，有望成为潜在的诊断标志物与治疗的靶点。Tahira[2]等通过cDNA转录组芯片技术发现胰腺癌组织筛选的335个lncRNA中,3个内含lncRNA与胰腺癌转移及凋亡密切相关，分别转录于MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1位点，并运用荧光定量RT-PCR等技术证实这3个lncRNA为编码蛋白基因。笔者通过荧光定量RT-PCR技术在60例胰腺癌及癌旁组织中筛选出表达量最高的胰腺癌特异相关长链非编码RNA靶基因，为后续进一步揭示胰腺癌发生发展的新机制提供靶基因。

1资料与方法

1.1一般资料Trizol试剂、lncRNA提取试剂、荧光定量RT-PCR试剂盒、SYBR Green Ⅰ荧光染料购自美国Invitrogen公司。标本收集：60例胰腺癌组织及癌旁组织标本，来源于2012年6月-2014年12月于我院行手术治疗的患者，术前未行放疗或化疗，术后病理确诊为胰腺癌的肿瘤组织(T)和癌旁正常组织(N)的液氮冻存标本。标本采集均经过患者家属同意并签属知情同意书，并经医院伦理委员会审核通过。

1.2总RNA的提取与RT-qPCR经Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提组织总RNA，焦磷酸二乙酯(DEPC)水复溶后，用核酸蛋白分析仪测定总RNA浓度，根据A260/A280比值和1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳RNA条带完整性鉴定总RNA质量。取2ng总RNA加入逆转录试剂盒(Invitrogen公司)进行逆转录反应，得到cDNA溶液，加80μl DEPC稀释后，置-20℃保存。用SYBR Green I PCR检测试剂盒对5μl cDNA溶液进行荧光定量PCR，MAP3K14引物序列：上游为5’-ATTTGCTCCTGCTCCTCCAGA-3’，下游为5’-CCAGCCTCCTCCCAGTCTTTC-3’；PPP3CB引物序列:上游为5’-AAAGAGCTCTCTTCCCTCTTGCG-3’，下游为5’-CTGTGAATGTGGGAAGGTGCATTG-3’；DAPK1引物序列：上游为5’-GGTTCTCGCTCTTGTTGCGTG-3’，下游为5-TACTGACGGAA-ACACTGGCGG-3’；内参照GAPDH引物序列：上游为 5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游为 5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性110s，60℃退火30s，70℃延伸30s，共40个循环；解链曲线分析：95℃ 1min，55℃ 30s；然后缓慢升温至95℃，升温速率为0.2℃/s，最后得到扩增曲线图和解链曲线图。本研究采用2-△△Ct法分析目的lncRNA的相对表达水平，以上具体操作依试剂盒说明书进行。

2结果

长链非编码RNA MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 3种基因在胰腺癌及胰腺癌旁组织中均有表达，其基因的表达量详见表1。三组基因在胰腺癌组织的基因表达量两两比较有差异(P<0.01，F=32.37)，在胰腺癌旁组织的表达两两比较差异显著(P<0.01，F=296.6)，三组基因在胰腺癌组织中的表达水平均低于在各自的胰腺癌旁组织的表达水平，其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表达量最高。

3讨论

胰腺癌是世界上恶性程度及死亡率最高的常见肿瘤之一，由于其起病隐匿，临床上缺乏有效的早期诊断手段及有效的治疗方案[3，4]，尽管手术切除能够起到一定程度的治疗作用，但是胰腺癌患者的5年生存率仍然低于5%[5]，目前在这方面的临床研究及肿瘤实验学有较大的进步，但胰腺癌的预后仍然不尽如意[6];因此，寻找高特异性的早期分子标志物，进一步深入研究胰腺癌的发生发展机制对于胰腺癌的早期诊断、治疗意义重大。

表1　三组基因在胰腺癌及癌旁组织的

笔者利用荧光定量RT-PCR技术检测长链非编码RNA MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 3组基因在60例胰腺癌及胰腺癌旁组织中均有表达(P<0.05)，且在胰腺癌组织的表达水平低于胰腺癌旁组织(P<0.05)；而Tahira等的研究也发现MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 三组基因在胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤组织和非肿瘤组织中存在表达差异，这说明笔者检测的结果与Tahira等的研究一致；Tahira等发现胰腺导管腺癌(PDAC)或转移癌的发生与胰腺组织中基因间区lncRNA的丰度有相关性，提示这类转录产物与胰腺癌的生物进程、恶性转化和转移有潜在的关系，而在笔者的检测结果中发现三组基因在胰腺癌组织及癌旁组织两两对比差异显著(P<0.05)，其中DAPK1基因在胰腺癌组织及癌旁组织中表达水平最高，且在胰腺癌组织中表达低于癌旁组织，说明DAPK1基因可能与胰腺癌的发生发展、生物进程、恶性转化和转移有潜在的关系，是胰腺癌的一种可能的抑癌基因。

近年研究表明，lncRNA与人类多个肿瘤发病关系密切，可在多个水平广泛参与基因表达调控网络的构成，调控肿瘤发生、发展，并与肿瘤的侵袭、转移及患者预后密切相关[7,8]，然而，DAPK1是否在胰腺癌的发生发展中也扮演着重要的角色，是否是胰腺癌高特异性的早期分子标志物，仍有待深入探讨。

参考文献

[1]Jia H，Osak M，Bogu GK，etal．Genome-wide computational identification and manual annotation of human long noncoding RNA Genes〔J〕.RNA,2010,16(8):1478-1487.

[2]Tahira AC,Kubrusly MS,Faria MF,etal.Long noncoding intronic RNAs are differentially expressed in primary and metastatic pancreatic cancer〔J〕.Mol Cancer,2011,13(10):141.

[3]Shrikhande SV,Gupta S,Ostwal V.Metastatic pancreatic cancer:another-option?〔J〕.Natl Med J India,2011,24(6)356.

[4]Tajiri T,Tate G,Matsumoto K,etal.Diagnostic challenge: intraductal neoplasms of the pancreatobiliary system〔J〕.Pathol Res Prac,2012,208(11):691-696.

[5]Hezel AF,Kimmelman AC,Stanger BZ,etal.Genetics and bi-

ology of pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Genes Dev,2006,20(10):1218-1249.

[6]Mardin WA,Haier J,Mees ST.Epigenetic regulation and role of metastasis suppressor genes in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.BMC Cancer,2013,29(13):264.

[7]邵永富,蒋孝明,等.长链非编码RNA在消化系统肿瘤发生中的作用〔J〕．中国细胞生物学学报，2013,35(9):1357．

[8]郑清盛,王守铭,吴大庆，等.长链非编码RNA在肝细胞肝癌组织中的表达及临床意义〔J〕．中华实验外科志,2014,31(4):840-842．

(编辑落落)

摘要目的：筛选并明确胰腺癌特异相关长链非编码RNA(lncRNA)在胰腺癌及癌旁组织中的表达差异，并对其进行初步分析。方法：采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测筛选验证胰腺癌特异相关长链非编码RNA MAP3K14、PPP3CB、DAPK1 3种靶基因在60例胰腺癌组织及配对癌旁组织表达差异最强的目标lncRNA，为胰腺癌特异相关lncRNA的功能研究做铺垫。结果：长链非RNA MAP3K14,PPP3CB, DAPK1在各自的胰腺癌及癌旁组织中的表达水平均有意义(P=0.000，t=17.32；P=0.000，t=15.045；P=0.013，t=34.55)；在胰腺癌组织的表达量两两比较有差异(P<0.01，F=32.37)，三组基因在胰腺癌旁组织的表达水平两两比较差异显著(P<0.01，F=296.6)，其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表达量最高。结论：三种长链非编码RNA在胰腺癌及癌旁组织中明确表达，其中DAPK1基因表达量最高，说明DAPK1与胰腺癌的发生发展有关，且在胰腺癌组织中表达低于癌旁组织，说明DAPK1是胰腺癌一种可能的抑癌基因。

关键词胰腺癌长链非编码RNA筛选验证

Screening Verification and Analysis of Specific Long Non-coding RNA Relevant Target Genes of Pancreatic Cancer

XU Shengqian,QIN Yong,YE Guanxiong,etal.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeopleHospitalofLishuiCity,ZhejiangProvince323000

ABSTRACTObjective:To screen and identify the differentially expressed of specific long non-coding RNA relevant target genes of pancreatic cancer between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues,and analysis it preliminary.Methods:To screen the differentially expressed of specific long non-coding RNA MAP3K14,PPP3CB, DAPK1 of pancreatic cancer between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues in 60 cases by RT-qPCR,which was prepared for the functional study of pancreatic cancer specific relevant lncRNA.Results:The expression levels of MAP3K14,PPP3CB, DAPK1 were significance between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues respectively (P=0.000，t=17.32；P=0.000，t=15.045；P=0.013，t=34.55);the expression of three genes are different in pancreatic tissue,(P<0.01，F=32.37),the expression of three sets of gene in adjacent pancreatic tissue of pairwise comparisons were significant (P<0.01,F=296.6),which the expression of DAPK1 was highest in pancreatic cancer and paracancerous tissues.Conclusion:Three long non-coding RNAs in pancreatic cancer and adjacent pancreatic cancer tissue were expressed clearly, which DAPK1 expressed highest, this shows that DAPK1 was related to the occurrence and development of pancreatic cancer, and the expression level of DAPK1 in pancreatic cancer tissues was lower than that in the adjacent tissues, indicating that DAPK1 is a possible tumor suppressor genes of pancreatic cancer.

KEY WORDSPancreatic cancer，Long non-coding RNA，Microarray

收稿日期2015-04-27

中图分类号：R735.9

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)17-2288-03

基金项目：丽水市科学技术局公益性应用技术项目(2012jyzb13)。通讯作者：秦勇