雌激素受体阴性乳腺癌中神经胶质瘤致病因子1、基质金属蛋白酶-9的表达及其临床意义

周育宏，黄海林，杜哲明，陈　超，王学闽，曾　朋

330030南昌，武警江西总队医院普外科

雌激素受体阴性乳腺癌中神经胶质瘤致病因子1、基质金属蛋白酶-9的表达及其临床意义

周育宏，黄海林，杜哲明，陈超，王学闽，曾朋

330030南昌，武警江西总队医院普外科

一般认为，雌激素是促进乳腺癌发生进展的主要因素，但是ER阴性乳腺癌对雌激素刺激不敏感，内分泌治疗有效率低，复发转移发生率高，其发病机制需要进一步研究[1]。2011年Kwon等[2]报道，Gli1通过上调MMP增强ER阴性乳腺癌细胞株的转移和侵袭能力，认为引起ER阴性乳腺癌增殖的重要机制是Gli1对MMP表达的上调。Nagai等[3]同样报道，Gli1可以通过上调MMP-9表达导致癌细胞株生长。但上述有关两者间调控作用的报道均在体外预设实验条件下实现，实际人体病理状态下Gli1、MMP-9表达对ER阴性乳腺癌的促进作用是否存在，Gli1与MMP-9的表达是否相关均需要验证。本实验拟通过免疫组化Envision法检测ER阴性乳腺癌组织中Gli1、MMP-9、CD34的表达，分析Gli1、MMP-9表达之间的相关性及其临床意义，为研究ER阴性乳腺癌的增殖机制提供初步的临床依据。

1材料与方法

1.1材料收集我院2006-01至2013-10经手术切除且病理确诊的ER阴性乳腺癌标本64例，所有乳腺癌标本均有完整的临床、病理及常用免疫诊断资料。患者均为女性，术前未接受乳腺癌相关治疗，年龄30～86岁，中位年龄54岁。根据乳腺癌TNM国际分期法，Ⅰ期18例，Ⅱ期31例，Ⅲ期15例。病理类型：浸润性导管癌45例，浸润性小叶癌11例，导管内癌6例，黏液腺癌2例。

1.2方法Gli1购自Santa Cruz公司，MMP-9购自Abcam公司，CD34购自DAKO公司，均为鼠抗人单克隆抗体。DAB显色剂购自华美生物工程公司。采用免疫组化Envision法，操作严格按照说明书进行。蜡块做连续4 μm切片，置于防脱载玻片上，二甲苯脱蜡，50 μl 3% 过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性，pH 6.0枸橼酸液加热修复抗原，10%羊血清封闭，分别滴加三种一抗(Gli1抗体配比1∶50，MMP-9抗体配比1∶200，CD34抗体配比1∶100)。4℃孵育16 h，加入羊抗鼠二抗，DAB镜下显色、复染、脱水、封片。以Tris缓冲盐水(TBS)代替一抗作为阴性对照，已知对应阳性乳腺癌组织切片作为阳性对照。

1.3免疫组化染色评价标准及统计Gli1为细胞核、细胞浆同时染色，以细胞核染色为判定标准。MMP-9为胞浆染色，CD34为微血管内皮染色。在100倍镜下找到癌细胞或微血管生成较集中的区域，该范围内200倍镜下随机取3个视野进行计数。

1.3.1Gli1及MMP-9表达评估采用 Sinicrope等[4]的免疫反应评分法(IS)：兼顾细胞染色强度及染色百分比。染色细胞占视野内细胞百分比≤5%记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，≥76%记4分。根据不同抗体显色不同，无染色记0分，弱染色记1分，中度染色为2分，深度染色为3分(染色强度判定参照Haaf等[5]Gli1染色深度评分)。两者积分相乘，0、1分为“-”，2、3分为“+”，4、6分为“++”，8、9、12分为“+++”。≤3分为低表达，≥4分为高表达[6]。

1.3.2CD34表达评估表达强度用MVD表示。根据Weidner等[7]的计数法：视野中染色的血管内皮细胞或细胞簇，只要能和其他血管、肿瘤细胞及组织区分开，就记为一个微血管单位。细胞簇部分超出视野，仍记为一个血管单位。管腔超过8个红细胞直径的血管壁细胞不计数。ER及HER-2表达判定均以病理报告为准：SP法ER细胞核染色<10%判定为阴性，荧光原位杂交(fish)HER-2/CEN17<2.2为阴性。上述读片及计数均由两名病理科医师独立完成，差异大于1分重新读片判定，MVD取平均值。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验，MVD组间比较用单因素方差分析，相关性分析用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Gli1、MMP-9表达与临床特征的关系Gli1及MMP-9表达强度均与肿瘤大小、TNM分期有关(P<0.05)，Gli1表达与淋巴结转移、HER-2表达无关。MMP-9表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，与HER-2表达无关。两者均与肿瘤大小及分期进展呈正相关，MMP-9的表达与淋巴结转移呈正相关(表1)。

表1　雌激素受体阴性乳腺癌中Gli1、MMP-9表达

2.2Gli1、MMP-9表达与MVD的关系Gli1、MMP-9阴性(-)、低表达(+)、中表达(++)及高表达(+++)组MVD均数组间差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。MVD随Gli1、MMP-9表达增强而增高，表明Gli1及MMP-9的表达是促进ER阴性乳腺癌微血管增殖的重要因素。

表2雌激素受体阴性乳腺癌Gli1、MMP-9不同表达

强度组MVD值比较

表达强度MMP-9例数MVDGli1例数MVD-1148.15±8.441348.83±7.53+2161.69±10.711460.69±10.02++1867.76±14.032064.68±12.92+++1473.11±12.781775.91±11.30F10.1315.41P<0.05<0.05

2.3Gli1与MMP-9表达的关系Gli1和MMP-9表达存在一定正相关性(r=0.462，P<0.01，表3)。

表3　雌激素受体阴性乳腺癌Gli1与MMP-9的关系

3讨论

对Gli1的认识源于对Hedgehog信号通路的研究。Hedgehog信号通路是一类高度保守的信号途径，在进化中表现十分稳定。通路生理状态下阶段性激活与胚胎发育有关，病理状态下其过度激活导致包括乳腺癌在内的多种肿瘤的发生[8]。Gli1是Hedgehog通路下游重要的限速因子，能够激活myc、snail、Bcl-2等多种癌基因的转录，是研究Hedgehog通路致乳腺癌机制的重要靶点。Kubo等[9]报道，乳腺癌组织中Hedgehog通路相关蛋白Gli1、SHH、Ptch表达与ER表达相关。Zhao等[10]发现，Gli1过表达可抑制乳癌细胞ER的表达并减低细胞对雌激素的敏感性。后期研究又发现ER的表达能促进Gli1表达，并且不受雌二醇浓度的影响[11]。综合其结论，Gli1表达可抑制ER表达并促进ER阴性乳腺癌细胞株的生长。

本研究分析了Gli1对ER阴性乳腺癌临床特征的影响，发现Gli1表达显著促进乳腺癌微血管增殖，半定量组间比较已呈现出两者间的量化效应，即MVD随着Gli1表达增强而升高。同时，还证明Gli1表达与乳腺癌肿瘤大小和TNM分期呈正相关，推测Gli1表达是促进ER阴性乳腺癌肿瘤增大和TNM分期进展的重要因素。目前已知肿瘤生长与微血管增殖关系密切，原发肿瘤超过0.1 mm就需要新生血管的营养支持，才能继续浸润和发生转移。综合分析上述临床资料表明，Gli1表达促进ER阴性乳腺癌进展的具体方式可能是通过促进血管增殖，为乳腺癌细胞提供充分营养支持，从而引起肿块不断增大进而改变临床分期。本结果显示Gli1表达与HER-2无明显相关(P=0.556)，可能是Hedgehog通路与后者的作用机制不同，两者源于不同分子途径。而本研究发现Gli1表达无明显促进淋巴结转移的作用，从侧面反映乳腺癌是复杂的分子异构体，其临床特征表现是多因子共同作用的结果。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族(MMPs)重要成员，理论上能够分解Ⅳ型胶原蛋白破坏基底膜，从而使癌细胞顺利进入血管或淋巴管引起肿瘤转移[12]。本实验研究MMP-9表达与ER阴性乳腺癌特征的关系，发现MMP-9表达促进乳腺癌微血管增殖，并初步体现出量化效应，即MVD随着MMP-9表达增强而升高。同时，实验还得出ER阴性乳腺癌组织中MMP-9表达不仅与肿瘤大小、临床分期呈正相关，而且与淋巴结转移呈正相关，可推测MMP-9表达通过血管和淋巴两种途径促进ER阴性乳腺癌增殖转移。临床表现与上述MMP-9相关的破坏基底膜引起肿瘤转移的理论一致。

Gli1与MMP-9表达对ER阴性乳腺癌特征的影响较一致，从外在表现上看，两者有存在调控关系的基础。进一步对两者相关性进行分析，结果为中度正相关性(r=0.462，P<0.01)，在一定程度上验证并支持了前述体外实验报道中两者存在正调控关系。说明ER阴性乳腺癌的发生进展的作用机制之一可能是：Hedgehog信号通路激活→Gli1表达→MMP-9表达→血管增殖→肿瘤生长→临床分期进展。可见Gli1是ER阴性乳腺癌增殖途径中重要的调控节点，为下一步以Gli1为靶点治疗ER阴性乳腺癌提供初步的临床依据。

【参考文献】

[1]Kurebayashi J. Current clinical trials of endocrine therapy for breast cancer[J]. Breast Cancer,2007，14:200-214.

[2]Kwon Y J, Hurst D R, Steg A D,etal. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERalpha negative breast cancer cell lines[J]. Clin Exp Metastasis,2011，28:437-449.

[3]Nagai S, Nakamura M, Yanai K,etal. Gli1 contributes to the invasiveness of pancreatic cancer through matrix metalloproteinase-9 activation[J]. Cancer Sci, 2008，99:1377-1384.

[4]Sinicrope F A, Ruan S B, Cleary K R,etal. bcl-2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis[J]. Cancer Res,1995，55:237-241.

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[6]Cui W, Wang L H, Wen Y Y,etal. Expression and regulation mechanisms of Sonic Hedgehog in breast cancer[J]. Cancer Sci, 2010，101:927-933.

[7]Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[J]. Breast Cancer Res Treat, 1995，36：169-180.

[8]Cohen M M.Nevoid basal cell carcinoma syndrome: molecular biology and new hypotheses[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 1999，28：216-223.

[9]Kubo M, Nakamura M, Tasaki A,etal. Hedgehog signaling pathway is a new therapeutic target for patients with breast cancer[J]. Cancer Res, 2004,64:6071-6074.

[10]Zhao J, Chen G, Cao D,etal. Expression of Gli1 correlates with the transition of breast cancer cells to estrogen-independent growth[J]. Breast Cancer Res Treat, 2010,119:39-51.

[11]赵洁莹,陈欢,王雁,等. 雌激素受体α在乳腺癌细胞中对Gli1转录活性和表达的影响[J]. 第二军医大学学报, 2009,30(11):1221-1224.

[12]Balduyck M, Zerimech F, Gouyer V,etal. Specific expression of matrix metalloproteinases 1, 3, 9 and 13 associated with invasiveness of breast cancer cells in vitro[J]. Clin Exp Metastasis, 2000,18:171-178.

(2014-10-18收稿2014-12-21修回)

(责任编辑尤伟杰)

【摘要】目的探讨雌激素受体(estrogen receptor ，ER)阴性乳腺癌中的神经胶质瘤致病因子1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli1)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表达及临床意义。方法用免疫组化Envision法检测ER阴性乳腺癌组织中Gli1、MMP-9、 CD34的表达情况, 分析Gli1、MMP-9表达与CD34、肿瘤大小、淋巴转移、临床TNM分期、HER-2表达的关系。结果ER阴性乳腺癌组织中，Gli1阴性(-)、低表达(+)、中表达(++)及高表达(+++)组的CD34分别为48.83±7.53、60.69±10.02、64.68±12.92和75.91±11.30； MMP-9分别为48.15±8.44、61.69±10.71、67.76±14.03、73.11±12.78，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。ER阴性乳腺癌组织中Gli1、MMP-9表达与肿瘤大小、临床TNM分期呈正相关(P<0.05)。ER阴性乳腺癌组织中Gli1与MMP-9表达存在一定正相关性(r=0.462，P<0.01)。结论Gli1与MMP-9表达呈正相关性，推测Gli1是ER阴性乳腺癌增殖途径中重要的调控节点之一。

【关键词】乳腺肿瘤；雌激素受体；免疫组织化学；Gli1；基质金属蛋白酶-9

【中国图书分类号】R737.9

Expression of Gli1, MMP-9 in estrogen-independent breast cancer and its clinical significance

ZHOU Yuhong, HUANG Hailin, DU Zheming, CHEN Chao, WANG Xuemin, and ZENG Peng. General Surgery Department, Jiangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Nanchang, 330030 China

【Abstract】ObjectiveTo study the expression and clinical significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (Gli1) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) in estrogen-independent breast cancer. MethodsThe expression of Gli1 protein was examined by Envision immunohistochemistry, Gli1, MMP-9 and CD34 expression were examined in ER-negative breast cancer. The relationships between them and CD34, tumor size, TNM stages, lymph node metastasis, HER-2 expression in ER-negative breast cancer were analyzed. ResultsThe expression of CD34 was enhanced by the expression of Gli1 and MMP-9 in ER-negative group(CD34 expression were 48.83±7.53，60.69±10.02，64.68±12.92，75.91±11.30 in different group of Gli1；CD34 expressions were 48.15±8.44，61.69±10.71，67.76±14.03，73.11±12.78 in different group of MMP-9), with significant differences (P<0.05). The expression of Gli1 and MMP-9 were correlated with tumor size and clinical TNM stages in ER-negative breast cancer (P<0.05). The expression of MMP-9 was also correlated with lymphatic metastasis (P<0.05). The correlation existed between the expression of Gli1 and MMP-9 in ER-negative breast cancer(r=0.462, P<0.01). ConclusionsClinical positive correlation exists between the expression of Gli1 and MMP-9, Gli1 is an important regulating point in estrogen-independent breast cancer growth way.

【Key words】breast cancer; estrogen receptor; immunohistochemistry; Gli1; matrix metalloproteinases-9

通讯作者：曾朋，E-mail:zengpengys@163.com

作者简介：周育宏，博士，副主任医师，E-mail: zhouyuhong0928@163.com