大鼠脑桥呼吸调整中枢神经元对低氧呼吸反应的调节作用

汪慧，杨俊卿，槐瑞托

(山东科技大学，山东青岛266590)

低氧呼吸反应是指在低氧环境中呼吸运动的适应性变化。在哺乳动物，急性低氧导致双相呼吸反应，即起始阶段的呼吸运动增强并达高峰和随后的逐渐减弱但持续高于常氧呼吸水平至低氧结束［1］，急性低氧刺激结束后，呼吸频率即刻下降至低于低氧刺激前水平，此现象称为低氧后呼吸频率下降(PHFD)［2，3］。1923年Lumsden通过实验提出脑桥呼吸调整中枢的概念［4］。背侧脑桥是传统意义上的脑桥呼吸调整中枢，主要结构是 KF核及 PB核［5～9］。研究表明，脑桥呼吸调整中枢对急性低氧引发的外周化学感受器反射的呼气或频率成份具有特异性影响［10，11］。2012年3月～2013年5月，我们系统观察了大鼠背侧脑桥N-甲基-D-天氡氨酸(NMDA)受体及γ-氨基丁酸(GABA)受体对低氧呼吸反应的作用，为进一步研究脑桥的呼吸调控功能提供了新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠20只，体质量250～450 g。所有动物手术过程和饲养方法符合世界脑研究组织发布的实验动物使用条例。

1.2 主要试剂 NMDA受体阻断剂D-2-氨基-5-磷酸基戊酸(D-AP5)和GABA受体阻断剂荷包牡丹碱(BIC)均为美国Sigma公司产品，D-AP5及BIC溶于人工脑脊液，稀释至10 mmol/L，注射剂量为20～50 nL。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备 30%的氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg)腹腔麻醉，皮下注射阿托品(0.1 mg/kg)减少呼吸道内腺体分泌，腹侧颈部游离并切断双侧迷走神经及C5膈神经。将神经浸润于液体石蜡中。股动脉及股静脉分别用于监测血压及静脉给药。三碘季铵酚(Sigma公司)肌松，气管插管接呼吸机给予人工通气。CO2监测仪持续监测终末呼出气CO2分压并使其维持在5%～5.5%。根据大鼠脑图谱［12］，将动物的头部以俯卧位固定于立体定位仪上，使前囟高于后囟约1.5 mm以便于电极插入。切开后囟附近的皮肤及其他组织，暴露颅骨，在后囟附近耳尖水平中线矢状缝一侧用电钻钻开一直径约5 mm的孔，去掉硬脑膜，暴露脑组织。所有暴露组织用液体石蜡覆盖。膈神经置于双极银丝电极，放电经CyberAmp380生物放大器放大后引入NI-DAQ数据采集卡(NI公司，美国)，通过Labview软件采样(10 kHz)记录，同时膈神经放电输入积分仪。

1.3.2 注射部位及方法 注射之前，先将钨丝微电极植入背侧脑桥(前囟后9.5～10 mm，中线旁开2.2～2.4 mm，背侧表面深入7.7～8.7 mm)内，给予电刺激，出现呼吸抑制效应的区域确定为注药位点。刺激参数:20～50 μA，频率80 Hz。使用PPM-2微量注射系统分别向背侧脑桥压力注射D-AP5(DAP5组，n=5)、BIC(BIC组，n=5)20～50 nL。向背侧脑桥KF核以相同速度注射同等剂量、pH值和渗透压的人工脑脊液作为对照组，以排除注射速度、浓度、pH值、渗透压对实验结果的影响。在背侧脑桥以外的区域(电刺激不引起呼吸抑制效应)微量注射D-AP5、BIC作区域对照。

1.3.3 低氧刺激方法 将人工通气气体从21%O2切换至8%O2(N2平衡)30～50 s。对照组给予低氧刺激前先记录1 min的膈神经放电作为基线，低氧刺激后再记录5 min作为后对照。向背侧脑桥分别微量注射D-AP5及BIC 20～50 nL，2 min后，给予8%O230～50 s，微量注射后90 min，待膈神经放电恢复到前对照水平再次给予8%O230～50 s。

1.3.4 指标观察方法 采用自编Matlab软件测量膈神经放电幅度(AMP)、吸气时间(Ti)、呼气时间(Te)，以60/(Ti+Te)为某呼吸周期的瞬时呼吸频率(f)。取急性低氧刺激前，对照组(1 min)内的平均AMP、Ti、Te、f的基线值。以基线值为标准对各个呼吸周期的AMP、Ti、Te、f进行标准化。以Te为例:标准化Te=［(Te-Te基线值)/Te基线值］+ 1。数据统计分4个时期，分别是前对照(低氧刺激前对照记录1 min期间平均呼吸参数);急性低氧期(低氧开始后20～30 s期间平均呼吸参数);PHFD期(低氧通气结束恢复正常通气后前10 s期间平均呼吸参数)以及后对照(低氧通气结束后6～7 min期间平均呼吸参数)。统计各阶段平均AMP、Ti、Te、f的测量值(绝对值)及标准化值。

1.3.5 统计学方法 采用自编Matlab软件。计量资料用s表示，组间比较采用Student's t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-AP5对低氧呼吸反应的作用结果 与对照组比较，D-AP5组急性低氧反应期膈神经f、Te、Ti及AMP变化无明改变(P均＞0.05);但PHFD期膈神经放电Te延长幅度及f下降幅度明显减小(P均＜0.05)，PHFD现象削弱。见表1。

表1 微量注射AP5前后两组低氧反应各指标改变情况比较(n=5，s)

表1 微量注射AP5前后两组低氧反应各指标改变情况比较(n=5，s)

注:与对照组比较，*P＜0.05。

组别 f(%)Te(%)Ti(%)AMP(%)急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期对照组 18.28±0.02 35.19±0.08 13.98±0.02 93.25±0.25 15.78±0.07 16.09±0.08 15.78±0.07 16.09±0.08 AP5组 16.33±0.04 17.89±0.07* 10.32±0.06 52.98±0.18* 20.46±0.07 27.31±0.10 20.46±0.07 27.31±0.10

2.2 BIC对低氧呼吸反应的作用结果 与对照组比较，BIC组急性低氧反应期膈神经放电f升高的幅度、呼气时间缩短的幅度均明显增大(P均 ＜ 0.05)，PHFD期膈神经放电无显著性变化(P均＞0.05)。见表2。

表2 微量注射BIC前后两组低氧反应各指标改变情况比较(n=5，s)

表2 微量注射BIC前后两组低氧反应各指标改变情况比较(n=5，s)

注:与对照组比较，*P＜0.05。

组别 f(%)Te(%)Ti(%)AMP(%)急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期对照组 25.49±0.02 36.65±0.07 24.43±0.02 89.57±0.21 5.66±0.02 21.8±0.05 8.14±0.04 17.14±0.06 BIC组 37.96±0.05* 29.41±0.09 31.29±0.04* 74.14±0.25 7.20±0.03*16.90±0.03 10.71±0.06 17.57±0.12

3 讨论

外周化学感受器反射是中介低氧呼吸反应的主要因素。存在于颈动脉体和主动脉体的外周化学感受器将刺激信息经窦神经和迷走神经传入［13～15］，止于延髓的孤束核［13］。我们实验室通过c-Fos蛋白免疫组织化学方法及CTB逆行标记方法研究了孤束核到脑桥背侧的功能通路。在脑桥背侧注射CTB可以在孤束核观察到逆行标记神经元。低氧刺激可以使部分逆行标记神经元表达c-Fos蛋白［13］。这表明低氧激活孤束核神经元，即外周化学感受器二级或更高级中继神经元。它们的轴突或轴突分支投射到并终止于背侧脑桥。我们还采用逆行兴奋方法研究了孤束核低氧敏感神经元向脑桥背侧区域的轴突投射。我们在大鼠孤束核共记录到30个神经元单位放电可被电刺激背侧脑桥逆行兴奋，逆行兴奋潜伏期在1.5～3.5 ms，平均2.4 ms。其中半数逆行兴奋神经元又可被低氧刺激兴奋［16］。

另一项研究发现，背侧脑桥的PB核选择性中介低氧呼吸反应的频率成份［10］。电损毁或化学损毁PB核后给予低氧刺激，低氧时呼吸频率升高的幅度降低了70%～80%，这主要是由于呼气时程缩短的幅度降低导致的。低氧时吸气时程缩短、吸气幅度增大及低氧后呼吸频率下降的现象没有明显变化。我们实验结果显示，在背侧脑桥，NMDA受体主要参与了PHFD现象的调控，GABA受体主要参与急性低氧时呼吸频率的调控。脑桥呼吸调整中枢通过整合来自于外周化学感受器的传入信息调节外周化学感受器所中介的低氧呼吸反应的频率成份。

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