快速检测金黄色葡萄球菌环介导等温扩增方法的建立与评价*

欧红玲，陈凤华，王 岩，张巧云，贾连玲，李雪丽，孙建华，王欣茹

(第二炮兵总医院检验科，北京 100088)



·论 著·

快速检测金黄色葡萄球菌环介导等温扩增方法的建立与评价*

欧红玲，陈凤华，王 岩，张巧云，贾连玲，李雪丽，孙建华，王欣茹△

(第二炮兵总医院检验科，北京 100088)

目的 探讨环介导等温扩增技术(LAMP)作为快速检测方法对金黄色葡萄球菌快速检测的可行性和可靠性。方法 建立LAMP反应体系，优化反应条件，进行灵敏度和特异度试验。结果 筛选出了LAMP反应检测金黄色葡萄球菌nuc基因的最佳引物组，最佳反应温度为62 ℃，LAMP和PCR检测nuc基因的最低检测限分别为1.47、14.7 pg/μL，检测金黄色葡萄球菌的特异度为100%。结论 LAMP具有操作简单、敏感度高、特异性强的特点，能够满足基层实验室、应急检测或现场检测等方面的使用需求。

环介导等温扩增技术； 金黄色葡萄球菌； 快速检测

金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，广泛分布于空气和水中，是一种条件致病菌，也是引起院内感染的常见微生物，可引起化脓、败血症、脓毒症等严重并发症[1-2]。但是目前对于怀疑金黄色葡萄球菌的患者，检测标本以明确病原菌和耐药性的所需时间一般为3～5 d，在此之前的抗菌药物治疗只能凭经验用药，所以迫切地需要一种能快速、准确地确定是否为金黄色葡萄球菌的检测方法。环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年日本荣研会社的Notomi等[3]开发出来的一种DNA恒温扩增方法，具有高特异性、高灵敏性、简便、快速和低成本的特点，被广泛应用于包括微生物、寄生虫检测在内的诸多领域。金黄色葡萄球菌的特异性基因为nuc基因，本研究旨在建立一种快速检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法，优化反应条件并对该方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 标准菌株ATCC25923，采集2014年1～3月本院送检的痰液、尿液、血液、胆汁和腹水等标本进行细菌培养。用法国梅里埃全自动细菌分析仪鉴定之后，留取菌种备用。

1.2 仪器与试剂 LRH-250细菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、朗普DNA扩增试剂盒(批号3Z007，荣研生物科技有限公司)，LA-320朗普浊度实时分析仪(荣研生物科技有限公司)，细菌DNA提取试剂盒(批号DP302，天根生化科技有限公司)，PCR扩增试剂盒(批号KT201，天根生化科技有限公司)，170-8170凝胶成像仪(美国Bio-rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 从NCBI基因库下载nuc基因序列，使用蓝谱公司Primer Explorer Version 4软件设计金黄色葡萄球菌特异基因nuc的5组引物，每组引物均包括外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)，另外为了提高扩增效率，对引物组还设计了多对环引物(LB和LF)，引物由北京奥科生物技术有限公司合成。

1.3.2 菌液制备 将标准菌株及冻存金黄色葡萄球菌菌株用牛肉汤培养增菌，转种于血平板上，置于37 ℃孵箱中孵育18～24 h。取2～4个复苏菌落溶于1 mL去离子水中制成菌液。

1.3.3 DNA模板制备及LAMP扩增 按照天根试剂盒说明书离心菌液后收集沉淀加溶菌酶与蛋白酶K消化(37 ℃，30 min)，然后加入无水乙醇和各种缓冲液抽提，洗脱沉淀得到纯化的DNA，提取的DNA保存于-20 ℃冰箱备用。LAMP反应条件优化试验及敏感度试验选用标准菌株DNA作为模板，特异度试验用临床标本菌株DNA作为模板。LAMP反应体系：根据试剂盒要求，FIP和BIP各40 pmol，F3和B3各5 pmol，LF和LB各20 pmol，Bst DNA 聚合酶1.0 μL，加入去离子水，加入2.0 μL模板配成25 μL反应体系。将已配制好、分装完毕的反应管置于Loopamp浊度实时分析仪装置中，在62 ℃下恒温55 min，80 ℃下恒温5 min灭活酶终止反应。Loopamp浊度实时分析仪记录反应中由于扩增产生的浊度(400 nm)，并绘制浊度曲线。另外，如果需要目测反应结果，在反应混合液中加入1.0 μL目测荧光试剂，同样配成25 μL反应体系，反应结束后管内液体呈绿色，判为阳性；液体仍为橙色则为阴性。

1.3.4 反应条件的优化 (1)最佳引物组的筛选：将针对nuc基因设计的5组引物分别进行等温扩增，观察反应中的浊度曲线，以最先出现指数增加的反应为最优。确定最佳引物组后，再将最佳引物组和不同环引物进行等温扩增，观察浊度曲线确定最佳环引物。(2)最佳反应温度的筛选：反应混合液在不同反应温度(66～65 ℃)反应55 min，然后80 ℃灭活5 min，观察LAMP反应中的浊度曲线，以最先出现指数增加的反应为最优，确定最佳反应温度。

1.3.5 LAMP反应的敏感度 使用LAMP对标准菌株经倍比稀释的DNA进行等温扩增，反应前在反应液内加入1 μL目测荧光试剂，反应55 min后80 ℃灭活5 min，肉眼观察其检测效果。采用PCR对倍比稀释的标准菌株DNA进行扩增，取5 μL扩增产物进行2%凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。

2 结 果

2.1 金黄色葡萄球菌最佳LAMP反应引物 由反应曲线(图1)可见，在5组引物组中，单独使用引物组4效果最好，所以引物组4为最佳引物组，另外，使用软件对引物组4设计出3对不同的环引物，将引物组4和环引物组合进行等温扩增，发现环引物1为最优。nuc基因的最佳引物为引物组4+环引物1，见表1。

注：1～7为nuc基因的不同引物组，分别表示引物组1、引物组2、引物组3、引物组4、引物组5、引物组4+环引物1、引物组4+环引物2、引物组4+环引物3。

图1nuc基因的不同引物组的反应曲线

2.2 最佳反应温度的筛选 采用不同的反应温度，进行等温扩增，扩增反应中的浊度曲线见图2，可见60 ℃反应最好，62 ℃和60 ℃相比差别不是很大。在临床工作中，常需要同时检测nuc和mecA，在同时开展的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实验中，筛选出的mecA的最佳反应温度为62 ℃，因此，本研究在nuc基因检测中也选了62 ℃作为最佳反应温度。

表1 nuc的最佳引物序列

注：1～6分别表示60、61、62、63、64、65 ℃条件下的浊度曲线。

图2 不同反应温度下的扩增曲线

2.3 LAMP反应的特异度 为了观察LAMP反应检测金黄色葡萄球菌的特异度，对20例菌株提取的DNA进行LAMP检测，由LAMP检测结果(如图3)可见，使用LAMP方法检测菌株nuc基因，只有金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株扩增阳性，其余的均为阴性，因此使用LAMP方法检测nuc基因来检测金黄色葡萄球菌的特异度为100%。

注：1～20分别表示耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌、头葡萄球菌、粪肠球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌、鹑鸡肠球菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、黏质沙雷菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽假单胞菌、溶血性葡萄球菌、耐甲氧西林表面葡萄球菌、路邓葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌。

图3 LAMP反应检测nuc基因的特异性

2.4 LAMP反应的敏感度 使用LAMP及PCR方法分别对倍比稀释的金黄色葡萄球菌DNA进行扩增，LAMP反应前在每份反应液内加入1 μL荧光试剂羟基萘酚蓝(HNB)，反应完毕后肉眼观察其检测效果(图3A)；PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像(图3B)。PCR的最低检测限为14.7 pg/μL，LAMP的最低检测限为1.47 pg/μL。

注：A为PCR扩增产物的凝胶成像结果；B为LAMP扩增产物肉眼观察结果；M为DNA标志物；1～7分别表示浓度为147 ng/μL、14.7 ng/μL、1.47 ng/μL、147 pg/μL、14.7 pg/μL、1.47 pg/μL、0.147 pg/μL的金黄色葡萄球菌DNA；8为未加入金黄色葡萄球菌DNA的阴性对照。

图4 PCR及LAMP 的敏感度

3 讨 论

金黄色葡萄球菌是医院感染的重要致病菌，可以产生多种致病因子，引起肌体局部缺血和坏死或急性胃肠炎等多种机体病变。近年来随着广谱抗菌药物的大量使用，金黄色葡萄球菌引起的医院感染及社区获得性感染的比例不断增多[4]。LAMP是一种新型的快速、特异性强和灵敏度高的核酸扩增技术，利用4种相异的特异性引物识别目标基因的6个特定区域，在Bst DNA聚合酶的作用下，60～65 ℃恒温条件下进行扩增，30～60 min后目标基因的数量能达到109～1010个拷贝数量级[5-6]，实现快速检测目标基因的目的。因其特异度强、敏感度高、方法简便，现已被应用于很多领域，如微生物、病毒、寄生虫的检测及动物胚胎的性别鉴定等[7-12]。

本研究针对金黄色葡萄球菌特异nuc基因设计LAMP 引物，并用该引物灵敏、快速地检测到金黄色葡萄球菌。整个反应过程快捷，只需要将反应混合液在恒温水浴锅或金属恒温仪62 ℃条件下保持60 min即可完成反应。另外，结果判定简便，既可通过直接观察反应管内有无沉淀生成，也可在反应液中加入荧光染料，肉眼观察直接判断结果。在验证LAMP反应的特异度中，只有金黄色葡萄球菌可扩增出nuc基因，其他葡萄球菌及非葡萄球菌均没有扩增出来，说明LAMP反应通过扩增nuc基因检测金黄色葡萄球菌的特异度为100%。PCR和LAMP检测nuc基因的最低检测限分别为14.7、1.47 pg/μL，说明LAMP的敏感度较PCR更高。

现在国内大多数研究者在采用LAMP进行检测时，往往选择对反应结果进行电泳或者在反应完成后添加SYBR Green Ⅰ荧光染料，这两种方法都使反应产物暴露于空气中，既污染了环境，还极易造成假阳性，而且电泳法检测LAMP反应产物并不能实时反映LAMP反应过程。本研究采用实时浊度仪和HNB检测，反应完成后不开盖，很好地杜绝了污染，有效防止了假阳性。但此次研究主要是对金黄色葡萄球菌DNA进行LAMP扩增，没有使用LAMP对临床标本进行检测，有待开展进一步的实验对临床标本进行研究。

总之，LAMP方法虽然扩增原理复杂，但其操作简便、用时少、灵敏度高、特异性强，再加上不需要复杂的仪器设备，能够很好地满足基层实验室、应急检测或现场检测等方面的使用需求，有望成为简易的常规检测手段。

[1]Khan S，Rasheed F，Zahra R．Genetic polymorphism of agr locus and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus at two hospitals in Pakistan[J]．Pak J Med Sci，2014，30(1)：172-176．

[2]Morell EA，Balkin DM．Methicillin-resistant Staphylococcus aureus：a pervasive pathogen highlights the need for new antimicrobial development[J].Yale J Biol Med，2010，83(4)：223-233．

[3]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al．Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]．Nucleic Acids Res，2000，28(12)：e63．

[4]潘云军,刘慧,郭卫红,等.医院感染金黄色葡萄球菌的临床特征及耐药性分析[J].国际检验医学杂志,2014,35(4):482-484.

[5]Koide Y,Maeda H,Yamabe K,et al.Rapid detection of mecA and spa by the loop-mediated isothermal amplification(LAMP) method[J].Lett Appl Microbiol,2010,50(4):386-392.

[6]Lim KT，Teh CS，Thong KL．Loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of Staphylococcus aureus[J]．Biomed Res Int，2013，2013：895816．

[7]李文桂,陈雅棠.环介导等温扩增技术用于消化道和呼吸道病毒检测的研究进展[J].重庆医学,2014,43(20):2662-2665.

[8]Nie K,Zhang Y,Luo L,et al.Visual detection of human enterovirus 71 subgenotype C4 and coxsackievirus A16 by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with the hydroxynaphthol blue eye[J].J Virol Method,2011,175(2):283-286.

[9]Ma XJ,Shu YL,Nie K,et al.Visual detection of pandemic influenza A H1N1 virus 2009 by reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye[J].J Virol Method,2010,167(2):214-217.

[10]李永刚,王德国,武建刚,等.环介导恒温扩增法 (LAMP) 检测金黄色葡萄球菌[J].食品工业科技,2010,31(1):388-391.

[11]Su J,Liu X,Cui H,et al.Rapid and simple detection of methicillin-resistance staphylococcus aureus by orfX loop-mediated isothermal amplification assay[J].BMC Biotechnol,2014,14(1):8.

[12]Zhao XH,Park MS,Zhang YH.Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the femA gene for rapid detection of Staphylococcus aureus from clinical and food samples[J].J Microbiol Biotechnol,2013,23(2):246-250.

Establishment and evaluation of a rapid method for detection of Staphylococcus aureus by loop-mediated isothermal amplification*

OUHong-ling,CHENFeng-hua,WANGYan,ZHANGQiao-yun,JIALian-ling,LIXue-li,SUNJian-hua,WANGXin-ru△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SecondArtilleryGeneralHospitalofPLA,Beijing100088,China)

Objective To investigate the feasibility and reliability of loop-mediated isothermal amplification(LAMP) in rapid detection of Staphylococcus aureus as a rapid detection method.Methods LAMP reaction system was established，the reaction conditions was optimized,the sensitivity and specificity experiments were carried out.Results The best primer set was selected to detect staphylococcus aureus fornucgenes through LAMP reaction.The best reaction temperature selected was 62 ℃，and the lowest detectable limits of LAMP and PCR fornucgenes were 1.47,14.7 pg/μL respectively.The specificities of two methods to detect Staphylococcus aureus were 100%．Conclusion LAMP detection method is simple,safe operation,with high sensitivity and high specificity,which can meet the need of grassroots laboratory,emergency detection and on-site testing and other aspects.

loop-mediated isothermal amplification (LAMP)； Staphylococcus aureus； rapid detection

全军“十二五”面上课题资助项目(CWS11J205)；军队“十二五”重大专项子课题资助项目(424135S)。

欧红玲，女，硕士，主管技师，主要从事分子生物学研究。△

，E-mail：wangxinru@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.016

A

1672-9455(2015)20-3012-03

2015-03-12

2015-06-15)