结直肠癌淋巴结转移与泛素结合酶UbcH10的表达

陈世敏，陈英剑，胡成进

(济南军区总医院实验诊断科，济南 250031)



·论 著·

结直肠癌淋巴结转移与泛素结合酶UbcH10的表达

陈世敏，陈英剑，胡成进△

(济南军区总医院实验诊断科，济南 250031)

目的 检测结直肠癌中泛素结合酶UbcH10的表达，并探讨其与结直肠癌患者临床病理特征和淋巴结转移的相关性。方法 采用免疫组织化学法检测结直肠癌组织及正常组织中UbcH10蛋白的表达量，分析其与结直肠癌患者临床病理特征的关系。采用Matrigel侵袭实验分析UbcH10对结直肠癌HT-29细胞株侵袭能力的影响。结果 UbcH10蛋白在正常组织细胞中几乎不表达，在结直肠癌组织的细胞核中高表达，并且表达水平与肿瘤的分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05)。Matrigel侵袭实验结果显示UbcH10过表达可显著增加HT-29细胞的体外侵袭能力。结论 UbcH10基因在结直肠癌患者肿瘤组织中过度表达，并与结直肠癌的疾病进展密切相关，可作为结直肠癌诊断和淋巴结转移的潜在肿瘤标志物及结直肠癌基因治疗的新靶点。

结直肠癌； 泛素结合酶UbcH10； 免疫组织化学； 淋巴结转移

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，全国肿瘤登记中心发布数据显示，近年来我国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，病死率位居恶性肿瘤第5位，并且有年轻化趋势。早期结直肠癌患者通过单纯手术治疗即可痊愈，但是由于疾病早期症状不明显，多数患者确诊时往往已到肿瘤晚期，约1/4的患者首诊时就已经出现转移致使预后不良。因此寻找结直肠癌的肿瘤标志物对于结直肠癌的诊断与治疗尤为重要。

泛素结合酶UbcH10是第10个被识别的人泛素结合酶，属于泛素结合酶E2家族的成员。泛素结合酶UbcH10不仅在泛素蛋白酶体系统中参与某些蛋白质的特异性降解，而且参与细胞周期调控，通过与细胞后期促进复合物(APC)相互作用影响有丝分裂纺锤体装配检测点，驱动有丝分裂中期细胞向有丝分裂后期转换[1]。有研究报道泛素蛋白酶系统与肿瘤的发生及进展密切相关[2]。近年来关于靶定泛素蛋白酶系统用于肿瘤治疗的报道也越来越受到研究人员的关注[3-4]。本研究采用免疫组化方法检测了45例结直肠癌患者组织中UbcH10的表达变化，分析了UbcH10的表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系，以及UbcH10的表达与结直肠癌淋巴结转移的关系,为结直肠癌的基因诊断及预后评估的方法学研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集手术切除的原发性结直肠癌患者肿瘤组织标本45例,以相应癌旁正常组织(距离肿瘤组织>5 cm)为对照。入选病例术前均未进行放、化疗，并且无长期服用非甾体类消炎药物史。结直肠癌诊断标准参照消化系统肿瘤世界卫生组织(WHO)分类2010年第4版第8章结肠与直肠肿瘤部分。人结直肠癌细胞株HT-29购自中国科学院上海细胞所，UbcH10真核表达载体pcDNA3.1-UbcH10的构建与鉴定见文献[5]。

1.2 主要试剂 UbcH10单克隆抗体为Santa Cruz公司产品；SP-9000 HistostainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒和辣根过氧化物酶标记的二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Matrigel试剂和Transwell小室购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色方法及结果判定 免疫组化染色采用链霉卵白素-辣根过氧化物酶(SP)法。UbcH10阳性染色呈深棕色，主要位于细胞核或细胞核伴细胞质内。实验结果通过显微镜计数阳性细胞百分比判定，每张切片选择5个高倍视野(HP)，每个HP计数100个细胞。具体判断标准按照：组织完全不着色或阳性细胞数不足5%为阴性(-)；组织阳性细胞数为5%～25%为UbcH10表达的阳性(+)；阳性细胞数>25%～50%为中阳性(++)；阳性细胞数占50%以上为强阳性(+++)，视为UbcH10高表达。

1.3.2 Matrigel侵袭实验 Transwell小室(孔径8 μm，直径6.5 mm)表面覆盖60 μL浓度为1 mg/mL的Matrigel，放至24孔板中室温干燥2 h。24孔板内加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液0.5 mL，小室上层加入浓度为5×105/mL的细胞悬液0.1 mL。37 ℃、5% CO2孵育24 h。棉签抹去小室上层未穿过的细胞并固定小室底部细胞，然后用结晶紫染色。200倍显微镜下观察并计数穿过小室的细胞个数，每孔选取5个不同的区域。

1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌肿瘤组织中UbcH10的表达水平 组织细胞中UbcH10阳性染色呈深棕色，主要位于细胞核，部分是细胞核伴细胞质内。正常对照组织细胞中几乎不表达(图1A)，而所有结直肠癌肿瘤组织中均有UbcH10蛋白表达(图1B～D)，二者差异明显(P<0.01)。肿瘤组织中UbcH10蛋白表达与结直肠癌分化程度相关，高分化肿瘤组织中表达相对较低，而预后较差的低分化肿瘤组织中表达较高，浸润灶中可见UbcH10表达明显增强(图1E)。

注：A为正常结直肠组织；B为高分化结直肠癌组织;C为中分化结直肠癌组织;D为低分化结直肠癌组织;E为局部转移灶。

图1 结直肠癌肿瘤组织中UbcH10的表达(×100)表1 结直肠癌UbcH10蛋白表达与临床病理特征的关系

注：与淋巴结未转移相比，*P<0.05；与高分化相比，#P<0.05。

2.2 UbcH10的表达与临床病理特征的关系 所有结直肠癌肿瘤组织中均有UbcH10表达，表达的强弱与患者年龄、性别及肿瘤大小无关(P>0.05)。肿瘤组织中UbcH10表达与肿瘤的分化程度及有无淋巴结转移相关(P<0.05)。高分化肿瘤组织中UbcH10表达以中等(+～++)程度为主(87.5%)，而低分化肿瘤组织中UbcH10高表达(+++)，可占70.0%。与未见淋巴结转移的结直肠癌患者(33.3%)相比，有淋巴结转移的患者肿瘤组织中UbcH10高表达的百分比(72.2%)也明显升高。见表1。

2.3 UbcH10对大肠癌HT-29细胞体外侵袭能力的影响 Matrigel侵袭实验结果显示，通过细胞转染获得的过表达UbcH10的大肠癌HT-29细胞组(pcNDA3.1-UbcH10组)平均每个HP有(120±10)个细胞穿过Transwell小室，而作为对照的PBS组和空载体组(pcNDA3.1组)大肠癌HT-29细胞穿过的细胞数分别是(71±9)和(66±7)个，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明UbcH10能明显增强大肠癌HT-29细胞的体外侵袭能力。

3 讨 论

泛素蛋白酶系统介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的重要机制，不仅能高效并高度选择性地进行细胞内蛋白质的降解，还参与和调控多种细胞生物学过程如细胞周期、基因转录、抗原提呈、细胞分化和凋亡等[6]。近年来随着对泛素蛋白酶体系统研究的深入，发现该系统在真核细胞增殖、凋亡、血管生成、运动等正常生理过程中起着重要的作用，而且系统异常造成的细胞内重要功能蛋白质降解失常与恶性肿瘤的发生和发展有着密切的关系[2]。有研究表明，泛素蛋白酶体系统不但参与调控结直肠癌上皮细胞的增殖与分化，还参与调控结直肠癌发病机制的常见损害[7-8]。

结直肠癌肿瘤组织及其癌旁正常组织中UbcH10表达的检测结果(图1)表明：泛素结合酶UbcH10的表达与肿瘤的发生、发展密切相关，特别是局部浸润灶组织中泛素结合酶UbcH10的表达更是与其周围正常组织形成了鲜明对比。在此基础上对收集标本中泛素结合酶UbcH10的表达与临床病理特征进行统计分析发现：UbcH10在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织中UbcH10基因的蛋白表达水平(P<0.01)，而且表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结是否转移密切相关。因此，本研究认为UbcH10基因与结直肠癌的发生、发展密切相关，可作为结直肠癌诊断的潜在肿瘤标记物及结直肠癌基因治疗的新靶点。

结直肠癌淋巴结转移与肿瘤的分期和临床治疗方案的制订密切相关，也是影响其预后的最重要因素之一。目前，诊断淋巴结转移的金标准是病理组织学检查，然而它会受到手术中淋巴结清扫范围、取检淋巴结的方法及淋巴结微转移的客观存在等因素的影响。临床上一些病理分期为早期的患者出现预后差的情况，就可能与没有发现存在的淋巴结转移灶有关。本研究中，结直肠癌患者肿瘤组织标本的免疫组化结果(图1E)及临床病理学特征分析(表1)均提示UbcH10表达与肿瘤的侵袭转移有关。UbcH10在结直肠癌淋巴结转移患者中的表达明显高于无淋巴结转移患者，而且UbcH10在局部的肿瘤浸润灶中表达升高。

众所周知，恶性肿瘤是一种人体细胞异常而且无限制的增生。除了细胞生长失控的基本生物学特性外，肿瘤细胞的转移侵袭性也是其重要生物学特征之一。为了进一步探寻泛素结合酶UbcH10的表达与结直肠癌淋巴结转移的关系，在细胞水平研究了UbcH10对结直肠癌细胞HT-29侵袭能力的影响。根据实验结果推测结直肠癌淋巴结转移的潜在原因可能是UbcH10的表达改变影响到细胞侵袭能力的变化而导致的。因此，认为UbcH10的检测不仅可以作为结直肠癌的肿瘤预后标志物，而且可用于结直肠癌淋巴结转移的辅助诊断。

越来越多的研究表明，恶性肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞分裂周期中所涉及的相关蛋白和基因的改变都会导致肿瘤的发生。结直肠癌是经多阶段多基因改变而发生的，从目前的研究来看,细胞周期调控系统和结直肠癌的发生、发展有密切联系,但其基因调控机制不十分清楚。对于UbcH10作用的分子机制是直接参与细胞周期调控引起肿瘤的发生、发展，还是通过泛素蛋白酶途径间接引起，值得进一步研究来阐明。

[1]Gramont A,Ganier O,Cohen-Fix O.Before and after the spindle assembly checkpoint——an APC/C point of view[J].Cell Cycle,2006,5(18):2168-2171.

[2]Engel K,Bassermann F.The ubiquitin proteasome system and its implications for oncology[J].Dtsch Med Wochenschr,2013,138(22):1178-1182.

[3]Grande E,Earl J,Fuentes R,et al.New targeted approaches against the ubiquitin-proteasome system in gastrointestinal malignancies[J].Expert Rev Anticancer Ther,2012,12(4):457-467.

[4]Shen M,Schmitt S,Buac D,et al.Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy[J].Expert Opin Ther Targets，2013,17(9):1091-1108.

[5]陈世敏,徐春晓,刘斌，等.UbcH10及其siRNA真核表达载体的构建与表达[J].放射免疫学杂志,2009,22(4):382-384.

[6]Thompson SJ,Loftus LT,Ashley MD,et al.Ubiquitin-proteasome system as a modulator of cell fate[J].Curr Opin Pharmacol,2008,8(1):90-95.

[7]Aragaki M,Tsuchiya K,Okamoto R,et al.Proteasomal degradation of Atoh1 by aberrant Wnt signaling maintains the undifferentiated state of colon cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,368(4):923-929.

[8]Voutsadakis IA.Peroxisome proliferator activated receptor-γ and the ubiquitin-proteasome system in colorectal cancer[J].World J Gastrointest Oncol，2010，2(5):235-241.

Lymph node metastasis of colorectal cancer and expression of UbcH10

CHENShi-min,CHENYing-jian,HUCheng-jin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Ji′nan,Shandong250031，China)

Objective To detect the expression of UbcH10 in colorectal cancer(CRC),and to investigate its correlation with the clinicopathological characteristics and lymph node metastasis.Methods The expression levels of UbcH10 in CRC tissues and the normal tissues in patients with CRC were detected by immunohistochemistry.Its correlation with the clinicopathological characteristics were analyzed.The influence of UbcH10 overexpression on the invasive ability of HT-29 cells was detected by using the Matrigel invasion assay.Results The UbcH10 protein was hardly expressed in normal control colorectal tissues,but highly expressed in the cell nucleus of CRC tissues,moreover its expression level was correlated with the differentiation degrees and lymph node metastasis of CRC(P<0.05).The result of the Matrigel invasion assay showed that the UbcH10 overexpression could significantly increase the in vitro invasive ability of HT-29 cells.Conclusion UbcH10 gene is overexpressed in the tumor tissues of CRC patients,and is closely correlated with the progression of CRC,which may serve as a potential tumor marker of CRC diagnosis and lymphnode metastasis,and a new target point of CRC gene therapy.

colorectal cancer(CRC); UbcH10; immunohistochemistry; lymph node metastasis

陈世敏，女，博士，副主任技师，主要从事肿瘤分子生物学研究。△

，E-mail:hcj6289@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.025

A

1672-9455(2015)20-3035-03

2015-03-26

2015-07-10)