睡眠剥夺对大鼠脑内Aβ表达的影响*

陕西省人民医院神经内三科(西安710068)

刘 鹏 王 瑾△ 刘 玥 唐 鹏 李 锐▲

睡眠剥夺对大鼠脑内Aβ表达的影响*

陕西省人民医院神经内三科(西安710068)

刘 鹏 王 瑾△刘 玥 唐 鹏 李 锐▲

目的：观察睡眠剥夺(SD)后大鼠学习记忆功能及脑内Aβ含量的变化，探讨睡眠剥夺导致认知功能减退的机制。方法： 健康Sprague-Dawley大鼠32只随机平均分为4组，对照3d组(Control-3)，睡眠剥夺3d组(SD-3)，对照9d组(Control -9)，睡眠剥夺9d组(SD-9)。对照组自由食水，良好睡眠；睡眠剥夺组建立睡眠剥夺模型。各组在观察时间点进行Morris水迷宫评价学习记忆功能之后，断头取脑，用免疫组织化学染色方法观察海马区Aβ的表达情况。结果：①与对照3d组相比，对照9d组逃逸潜伏期及目标象限时间变化均不大(P>0.05)，但SD 3d组逃逸潜伏期延长，目标象限时间缩短(P<0.05)。与对照9d组相比，SD 9d组逃逸潜伏期明显延长，目标象限时间明显缩短(P<0.01)。与SD 3d组相比，SD 9d组逃逸潜伏期延长，目标象限时间缩短(P<0.05)。②与对照3d组相比，对照9d组海马区Aβ表达变化不大(P>0.05)，但SD 3d组海马区Aβ表达增多(P<0.05)。与对照9d组相比，SD 9d组海马区Aβ表达明显增多(P<0.01)。与SD 3d组相比，SD 9d组海马区Aβ表达增多(P<0.05)。结论： 睡眠剥夺可导致大鼠学习及空间记忆功能减退，且具有时间依赖性，其机制可能与睡眠剥夺可增加脑内海马区Aβ含量有关。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种神经系统慢性退行性疾病，为痴呆最常见的原因，约占全部痴呆的50%～60%左右[1]，其病理特征之一为脑内出现大量老年斑，核心成份是β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)。现已证实，Aβ沉积是AD最早的病理改变和发病的关键环节[2]。研究表明，睡眠剥夺(Sleep deprivation,SD)可导致记忆力下降，影响认知功能，与AD的发病有一定关系[3]。本文通过复制SD大鼠模型，观察不同时间长短的SD对大鼠的学习和记忆功能的影响，同时观察其脑内海马区Aβ的表达，进一步明确SD与AD的关系。

材料与方法

1 实验动物与分组 健康SD大鼠32只，5～7月龄，体重180±20g，雌雄不拘，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机平均分为4组，对照3d组(Control-3)，睡眠剥夺3d组(SD-3)，对照9d组(Control -9)，睡眠剥夺9d组(SD-9)。自由进食，食标准颗粒饲料，饮自来水。

2 动物模型制作及实验流程 使用改良多平台睡眠剥夺法(MMPM)[4]对大鼠进行睡眠剥夺，每日仅允许睡眠2h，睡眠剥夺期间室内40W白炽灯照明，睡眠期间保持室内黑暗，整个过程避免噪音。

实验前，每亚组8只大鼠同笼饲养，每天于多平台上适应2h，共2周，之后再开始正式实验。根据观察时间不同，睡眠剥夺分别进行3d、9d，对照组置于大平台，自由食水，良好睡眠。

每只大鼠在观察时间点处死前行Morris水迷宫认知功能测评，然后断头取脑，做脑组织切片免疫组织化学染色，观察大脑海马区的Aβ表达情况。

3 材料与试剂 兔抗大鼠Aβ、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、正常山羊血清均由武汉博士德公司提供；通用Morris水迷宫，上海吉量科技公司。

4 Morris水迷宫实验 大鼠熟悉环境l周，然后严格按文献记载进行定位航行实验和空间探索实验。由视频监视探头记录实验过程，每只大鼠在同一平台上游泳，记录动物找到平台逃逸的潜伏期，游泳总路程及游泳速度，共测试3次记录其平均值。允许其在120s内找到平台，找到后在平台上保持20s。若在120s内找不到平台，则将大鼠引导至平台上保持20s，并将潜伏时记录为120s。

5 脑组织切片的制作 麻醉后用0.9%氯化钠溶液和多聚甲醛进行心脏灌注固定，断头取脑。在大脑半球距嗅球尖端7～11mm之间冠状切取约5mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，片厚5μm。每只动物连续取3张切片,用于免疫组化染色。

6 脑组织Aβ免疫组化染色观察 取各组大鼠脑切片行Aβ免疫组化染色。应用图像信号采集与分析系统，光镜下随机计数大脑海马区各5个不重叠视野(×40)下Aβ阳性斑块个数求均数。

结 果

1 睡眠剥夺对大鼠学习及空间记忆能力的影响 见表1。

表1 各组大鼠水迷宫实验潜伏期和目标象限时间的比较(±s)

注：与Control-3比较*P<0.05;与Control-3比较#P>0.05;与Control-9比较△P<0.01;与SD-3比较△P<0.05

与对照3d组相比，对照9d组逃逸潜伏期及目标象限时间变化均不大(P>0.05)，但SD 3d组逃逸潜伏期延长，目标象限时间缩短(P<0.05)。与对照9d组相比，SD 9d组逃逸潜伏期明显延长，目标象限时间明显缩短(P<0.01)。与SD 3d组相比，SD 9d组逃逸潜伏期延长，目标象限时间缩短(P<0.05)

2 睡眠剥夺对大鼠脑海马区Aβ表达的影响 见表2。

表2 各组大鼠脑海马区Aβ斑块数的比较(±s)

注：与Control-3比较*P<0.05;与Control-3比较#P>0.05;与Control-9比较△P<0.01;与SD-3比较△P<0.05

与对照3d组相比，对照9d组海马区Aβ斑块数变化不大(P>0.05)，但SD 3d组海马区Aβ斑块数增多(P<0.05)。与对照9d组相比，SD 9d组海马区Aβ斑块数明显增多(P<0.01)。与SD 3d组相比，SD 9d组海马区Aβ斑块数增多(P<0.05)。

讨 论

本研究发现，睡眠剥夺(SD)可影响大鼠学习能力及空间记忆功能，且随睡眠剥夺时间延长而影响加大。同时，睡眠剥夺能增加大鼠脑内海马区淀粉样蛋白β(Aβ)的表达，同样存在时间依赖性。因此，我们认为睡眠剥夺与阿尔茨海默病的发生有密切关系。

AD为最常见的痴呆病因，严重危害人类健康，但其病因和发病机制还不完全清楚。在病理学上，AD以脑内出现大量老年斑和神经原纤维缠结为特征。其中老年斑的核心成份是Aβ。现已证实，Aβ沉积是AD最早的病理改变和发病的关键环节[2]，Aβ是淀粉样蛋白前体(APP)经过β分泌酶及γ分泌酶切割后的产物，由40(Aβ-40)或42～43(Aβ-42，43)个氨基酸组成的蛋白质。

有研究表明，睡眠障碍与AD发生发展有密切关系[5，6]。Brendan等发现，脑内Aβ浓度存在明确的昼夜波动，正常睡醒周期下，觉醒时脑内Aβ浓度增多，睡眠时Aβ浓度减少。可能与觉醒时神经元活动增多，产生Aβ增多超过了大脑对其的清除，睡眠时神经元活动减少，Aβ产生较少而清除增多所致。本研究发现，睡眠剥夺不但影响大鼠的学习能力和空间记忆能力，而且可增加大鼠脑内海马区Aβ的表达，且均有时间依赖性，有良好的一致性。说明睡眠剥夺可以增加脑内Aβ的表达，进一步促进AD的发生发展。但目前对睡眠障碍导致AD的具体机制尚不清楚，可能与下列学说有关：①神经元活性学说：研究表明，觉醒时间过长时神经元活性增强，活性增强的神经元可导致更多的Aβ沉积，睡眠时则相反；②应激反应学说：睡眠障碍是一种典型的应激源，可产生三种应激反应，即神经体液反应、氧化应激反应和内质网应激反应。研究表明，睡眠剥夺作为一种应激源，同其他应激形式如孤养，噪音干扰，气味干扰，强迫游泳等一样均可增加脑内Aβ沉积。③褪黑素学说：睡眠剥夺可使脑内褪黑素减少，而褪黑素有减少Aβ的生成，聚集及沉积，并可保护神经元免受Aβ的损害等作用，故睡眠剥夺可通过减少褪黑素影响AD的发生。

综上所述，本研究证实了睡眠剥夺可影响大鼠学习记忆功能，且具有时间依赖性，其机制可能是增加大鼠脑内海马区Aβ的沉积所致。

[1] Blennow K,De LM,Zetterberg H.Alzheimer'sdisease[J].Lancet,2006,368(9522):387-403.

[2] Henry W. Querfurth, Alzheimer’s Disease[J]. N Engl J Med,2010,362:329-344.

[3] Yo-El S J,Jennifer S. Sleep quality and preclinical Alzheimer Disease[J].JAMA Neurol,2013,70(5): 587-593.

[4] Zhang L,Zhao ZX.0bjectjve and subjective measures for sleep disorders[J].Neurosci Bull,2007,23:236-240.

[5] Antonio DM,Yash BJ,Domenico P. Sleep deprivation impairs memory, tau metabolism , and synaptic integrity of a mouse model of Alzheimer’ s disease with plaques and tangles[J].Neurobiology of Aging, 2014,35(8):1813-1820.

[6] Jae-Eun K,Miranda ML,Randall J.Bateman.Amyloid-βare regulated by orexin and the sleep-wake cycle[J].Science,2009,326(5955):1005-1007.

(收稿：2014-10-30)

*陕西省自然科学基础研究计划项目(2013JM4020)

睡眠剥夺 学习障碍 记忆障碍 淀粉样β蛋白 动物，实验 大鼠

R742

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.003

△西安交通大学医学院第一附属医院神经内科

▲通讯作者