小鼠胚胎切割技术在人类辅助生殖中的应用研究

西安交通大学医学院第二附属医院 (西安 710004)

康　瑛△　刘恩岐▲　郑华东　李昭荣#

小鼠胚胎切割技术在人类辅助生殖中的应用研究

西安交通大学医学院第二附属医院 (西安 710004)

康瑛△刘恩岐▲郑华东李昭荣#

目的：探讨将胚胎切割方法尽早应用于临床。方法：应用显微切割刀和酶消化透明带显微玻璃针分割两种方法：对2、4、8细胞期和桑椹期的胚胎分割为二分胚；将2、4、8细胞期的胚胎切割成卵裂球；同时将2细胞期的胚胎连续2次分割培养；切割的二分胚和卵裂球在M16溶液中行胚胎体外培养，观察其发育情况，达囊胚期植入子宫。结果：小鼠2、4、8细胞期的切割成功率分别为98.0%、86.6%、77.2%、66.1%，发育率为61.5%、80%、84.8%、89.3%；小鼠2、4、8细胞期切成的卵裂球发育至桑椹胚的成功率随着细胞数的增多而减少。小鼠2细胞期卵裂球的全能性优于4、8细胞期卵裂球。各细胞期半胚的发育率明显好于卵裂球的发育率。连续有两次切割2细胞期的胚胎发育到桑椹胚为15%。发育到囊胚的8细胞期和桑椹胚期的半胚移入假孕母鼠体内妊娠率分别为33.3%和60%。结论：显微玻璃针在切割成功率及后期的细胞成活率上优于纤维切割刀的切割方法。

胚胎分割技术是指用人工方法将一个植入前的胚胎分割成两个或多个部分，每一部分植入后发育成一个个体。Willadsen等[1]把这项技术应用于家畜,并在绵羊上获得成功。该技术广泛应用于家畜繁殖并取得了巨大的成功，并且在牛[2]、猪[3]、马[4]、兔[5]等动物上都获得二份胚、四份胚的后代。1990年Eaton[6]首次利用藻酸盐基质代替透明带来质次放置的2-细胞期小鼠胚胎的体外发育，使单个卵裂球发育至胚泡期。本研究采用不同的胚胎分割方法切割受精卵成半胚及卵裂球，并将单个卵裂球转入空的囊腔内，进行体外培养观察这两种切割后的胚胎在体外的发育情况，待其发育到桑椹胚期后移入假孕母鼠体内，对发育成个体的成功率进行分析。

材料与方法

1试验材料ICR小鼠(西安交通大学实验动物中心)。实验用小鼠均在SPF动物房饲养,温度控制在22±3℃,光控(12h明/12h暗),自由采食。Co60灭菌饲料(第四军医大学实验动物中心)；孕马血清(PMS,宁波激素厂)；绒毛膜促性腺激素(hCG,上海第一生化制药厂)；透明质酸酶(美国Sigma司)；PBS、M16培养液均为自制；CO2培养箱(美国Shellab公司)；体视显微镜(日本Nikon公司)显微手术器械；倒置显微镜(OLYMPUS IX-71)；纤维操作系统德国eppendof，拉针仪，断针仪。

2方法

2.1超排卵及胚胎的收集：饲养于控光条件(光照∶黑暗=12h∶12h)下的5～8周龄ICR雌性小鼠,实验第一天注射孕母马血清(PMSG)，于46～48h后给供体鼠注射绒毛膜促性腺激素(hCG) (0.5U/只)，hCG注射当日(实验第3日)下午和雄鼠合笼，次日7:00～8:00检查雌鼠有无阴栓以判定是否已经交配，在实验的第5、6、7天分别取受精卵的2、4、8细胞期、囊胚期。

2.2胚胎分割针的制作：在拉针仪上,以外径100mm的毛细玻璃管拉制分割针,分割针的细部长约130μm ,并在其前端烤弯约120度角,切割部位直径约1～5μm。

2.3纤维分割刀的制备：用剃须刀自治切割刀，将其与自制刀柄粘在一起，前面用于切割的部分最好不超过1mm，刀柄固定在纤维操作仪上。

2.4胚胎分割：对实验第5、6天的孕鼠处死后以PBS冲洗输卵管，对实验第7天的孕鼠处死后用PBS冲洗输卵管及子宫,在实体显微镜下,收集形态正常的2、4、8细胞期及桑椹胚期的胚胎用于分割试验。

2.4.1显微刀分割法：用手术刀片在直径35mm 塑料平皿盖上刮出一小块粗糙的平面(约2～4 mm)作为“分割床”,然后在其上覆盖约200μl的分割液小滴。分割时将胚胎置于“分割床”上，刀刃对准中线由上向下使囊胚、桑椹胚一分为二，对4、8细胞期的囊胚再进行半胚切割直至为卵裂球，将卵裂球装入准备好的透明带内。

2.4.2显微玻璃针分割法：首先用0.3%链酶蛋白酶处理后,直接在PBS液中进行分割。分割时,将胚胎的内细胞团一分为二，将分割的半胚分别在M16液中培养发育到桑椹胚再转入到假孕母鼠体内。将切割的单个卵裂球分别放入准备好的透明带内，在M16液中培养发育到桑椹胚。

2.5体外培养：用自配的含20%的胎牛血清的M16在50×50mm的培养皿作20～30μl的微滴，每滴放入10～20个卵，微滴上覆盖硅油，选择分割后成活的单个胚胎及半胚放入液滴内，移入CO2培养箱内24～72h，观察胚胎发育情况。

2.6假孕母鼠的准备：将体重在18～25g的雌属与结扎的公鼠合笼，第2天挑出有精栓的雌鼠作为移入的受体鼠备用，将发育到囊胚期的胚胎假孕母鼠体内。

结　果

1不同分割方法的对比应用显微分割刀、显微玻璃针两种方法，将2、4、8细胞期的胚胎切割二分胚，发现两种方法在统计学上明显的差异性，通过附图可以看到酶消化透明带显微玻璃针分割成功率高于显微刀切割，细胞切割的成功率随细胞数的增加而减少。在随后M16培养液中发育到桑椹胚期、囊胚期的发育率比较差异无统计学意义(P>0.05, χ2=1.18)，随着细胞数的增加其发育成功率也增加。

附图两种不同的切割方法切割2、4、8细胞期及桑椹胚期的细胞成功率比较

2两种不同方法分割成单个卵裂球的比较4、8细胞期进行卵裂球的切割时显微玻璃针的切割成功率明显高于显微刀的切割成功率，4细胞期(χ2=6.338，P<0.05)、8细胞期(χ2=17.454，P<0.001)，小鼠2、4、8细胞期切成的卵裂球发育至桑椹胚的成功率随着细胞数的增多而减少。小鼠的2细胞期的卵裂球的全能型优于4、8细胞期的卵裂球。2细胞期切割成卵裂球的成活率及发育到桑椹胚期最高。

32细胞期的受精卵连续2次分割对20个2细胞期的受精卵连续两次切割，发现最后有13个细胞发育到囊胚期，发育成功率15%，并且细胞形态良好。

4发育至桑椹胚期的卵转入到假孕母鼠体内的成功率分别选取发育到囊胚期的4细胞期和桑椹胚的半胚50、60个分别转入3、5只假孕母鼠体内，4细胞期直接的胚胎通过假孕母膨大的壶腹部注入到的输卵管中段，桑椹胚期直接注入到子宫内，孕20d，4细胞期有1只母鼠怀孕并产下2只小鼠，妊娠率33.3%。桑椹胚期有3只母鼠怀孕并产下9只小鼠，妊娠率60%。

讨　论

目前，对于人类早期胚胎卵裂球发育和分化潜力的研究较少。有文献报道早期胚胎的单个卵裂球具备进一步发育和分化成完整、正常个体的潜能。胚胎卵裂球的全能性实验的研究主要表现在具有重要的临床实用价值：按需要从胚胎中取出卵裂球作遗传病的早期诊断；从而达到优生优育的目的；通过卵裂球植入胚胎可能治疗单基因遗传病[7]；卵裂球具有全能性可诱导发育成各种干细胞，将其冷冻作为以后治疗某些疾病的手段；增加移植的胚胎数，提高体外受精的成功率。

胚胎分割所具有的优点正被人类生殖遗传学家广泛关注[8]。胚胎分割常用的方法主要有：显微手术刀或玻璃针切割胚胎；酶消化透明带显微玻璃针分割法。张涌等认为显微手术刀分割法最为理想，操作程序简化，用持卵器吸住胚胎，显微手术刀直接分割，胚胎在室温中暴露时间短利于胚胎的发育，操作熟练，每个胚胎约需1min左右。本试验的统计分析显示两种方法没有明显的差异性，从附图可以看出显微针切割的成功率明显高于显微刀的切割，因为显微手术刀直接分割胚胎时对卵裂球可能有损伤，尤其在操作较小的胚胎显微刀的操作难度明显加大。

Willadsen曾取牛8细胞期的胚胎的卵裂球培养，发现其同卵双胎及多胎的成功率明显减少。本试验对ICR小鼠2、4、8三个细胞期的胚胎切割成单个卵裂球，分别培养发现2细胞期卵裂球的发育和分化能力明显大于4、8细胞期的卵裂球。并且4、8细胞期卵裂球的发育潜能下降，并有多数的卵裂球发育异常。4细胞期以后如果胚胎细胞的组成数量严重减少将阻碍胚胎的生长发育。证实早期胚胎卵裂球进一步发育和分化潜力的大小，取决于该细胞的细胞期和分化的程度，随着发育过程的进展，其发育潜力不断降低；此外，细胞分化程度越低的卵裂球其发育成个体的可能性越大，4、8细胞期后卵裂球数量越少，发育程度越差。本试验还发现卵裂球的切割中显微针的切割明显优于显微刀的切割，可能与显微针较细小切割过程中组织损伤少有关。

对比半胚和单个卵裂球发育成囊胚的试验中发现，半胚发育至桑椹胚明显高于单个卵裂球的发育率，半胚体外培养，胚泡的发育率随胚胎细胞数增多而提高，对于细胞数目越少的半胚在体外培养的时间越长，发育率越低。大多数半胚可发育成有内细胞团和滋养层的囊胚期，少数发育成假囊胚或滋养囊。用胚胎切割作植入前胚胎遗传学诊断是一个非常好的方法，操作过程简便，细胞受损伤小，并且通过多次切割产生大量的受精卵，用于检测植入前胚胎的发育情况。Karl等采用半胚切割能切割3次，第一、二次的胚胎切割成功率和发育率都很理想，为临床解决这一问题提供了一种方法。

[1]Willadsen SM. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins[J]. Nature ,1979 ,227(25) : 298 - 300.

[2]Ozil JP,Heyman Y,Renard JP.Production of monozygotic twins by Micromanipulation and cervical transfer in the cow Vet[J].Rsc，1982,110:126-127.

[3]Nagashima H,Katoh Y.Production of normal piglet from microsurgical split morulae and blastocysts[J].Theriogenology,1988,29(2):485.

[4]Allen WR,Pashen RL.Production of monozygotic(identical) horse twins by embryo micromanipulation[J].Reprod Fertil，1984,71:607-613.

[5]Moore NW,Adams CE,Rowson LEA.Developmetal potential of singal blastomeres of the rabbit eggs[J]. Reprod Fertil，1968,17:527-531.

[6]Nancy LE,Glen PN,Michael CD.The use of an alginic acid matrix to support in vitor development of isolated murine blastomeres[J]. Journal of in vitro fertilization and embryo transfer, 1990,7(1):28-32.

[7]Illmensee K, Kaskar K, Zavos PM. In vitro blastocyst development from serially split mouse embryos and future implications for human assisted reproductive technologies[J]. Fertil Steril，2006，Suppl 4:1112-1120.

[8]Jones HW, Edward RG, Seidel GE. On attempts at cloning in the human[J]. Fertil Steril，1993，61:423- 426.

(收稿：2015-04-08)

胚胎分裂球动物，实验小鼠

R332

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.002

△陕西省妇幼保健院妇产科

▲西安交通大学医学院实验动物中心

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