紫外分光光度法测定鱼胆草中总黄酮含量

马海霞，何 珺，杨富茗

(1.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025; 2.贵州省生化工程中心，贵州贵阳 550025)



紫外分光光度法测定鱼胆草中总黄酮含量

马海霞1，何 珺2*，杨富茗1

(1.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025; 2.贵州省生化工程中心，贵州贵阳 550025)

[目的]研究鱼胆草及其不同部位中总黄酮含量分布情况。[方法]采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，三氯化铝显色后在波长420 nm处测定鱼胆草中总黄酮含量。[结果]芦丁浓度在0.005 ～0.025 mg/ml范围内与吸光度线性关系良好(r=0.999 3)，平均回收率为101.69%，RSD为2.21%(n=6)，鱼胆草中总黄酮的含量为2.510%。其中，鱼胆草不同部位根、茎、叶中，叶子总黄酮的含量最高，为2.542%。[结论]采用紫外分光光度法测定鱼胆草中总黄酮含量操作简便、准确可靠、稳定性好。

鱼胆草；总黄酮；不同部位；含量测定；紫外分光光度法

鱼胆草系龙胆科獐牙菜属植物，学名川东獐牙菜SwertiadavivdiiFranch，以全草入药，性寒、味苦，是湘西、鄂西、川东边区土家族苗族自治州民间常用于治疗肝炎、胆囊炎、结膜炎、痢疾等疾病的草药[1-2]。在《中药大辞典》和《全国中草药汇编》均有记载[3]，鱼胆草中富含的主要活性成分为黄酮类物质，其具有降血脂、降血糖、保护心肌、降压、抗心律失常、抗凝血、镇痛、抗炎、抗肿瘤、防治骨质疏松、抗氧化和延缓衰老等药理作用[4-6]。

迄今为止约有40余种獐牙菜属植物有文献报道，从这些植物中已分离出100多种不同类型的化合物，按化学架构其主要含四大类化合物[7]：三萜及其苷类，这类化合物含抗肝炎、降GPT的有效成分，有代表性的化合物为Oleanolic acid、1β，3β-poxy-hop-16-ene、三萜酸葡萄糖酯苷；环烯醚萜及其苷类，此类化合物中的有效成分对子宫平滑肌有较明显的解痉作用，同时还有镇静作用，獐牙菜苦苷和龙胆苦苷是其代表性的化合物；口山酮及其苷类，有强心、利胆、利尿、保肝等作用，对中枢神经有兴奋作用，且是抗真菌的主要成分，如8-O-β-D-葡萄糖-1,3,5-三羟基口山酮、芒果苷、1,3,5,8-四羟基口山酮；黄酮及其苷类，该类化合物含有治疗心血管系统疾病、急慢性肝炎、肝硬化、抗菌消炎的有效成分，代表性的结构为4′、5-二羟基-7-甲氧基黄酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、3′，4′，5，7-四羟基黄酮-6-C-D-吡喃葡萄糖苷、异当药黄素。而目前国内外还没有对鱼胆草中总黄酮含量测定的报道，采用1%三氯化铝对鱼胆草提取液显色，360 nm紫外灯下有明显的鲜黄色荧光，因此该研究以芦丁作为对照品，1%三氯化铝显色,紫外分光光度法对鱼胆草中总黄酮进行了含量测定，并对鱼胆草不同部位即其根、茎、叶中总黄酮含量进行了初步探索，为鱼胆草中黄酮类物质的研究与开发提供了理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。鱼胆草，2013年秋季采收晒干全草，由贵州大学农学院任明见教授提供并鉴定。并按全草、根、茎、叶分别分类80 ℃烘12 h,进行粉碎过80目筛,分别密封保存备用。

1.1.2 仪器。紫外可见分光光度计(UV-2550，日本岛津公司)；电子天平(BAS124S，赛多利斯科学仪器有限公司)；冰箱(BCD-205，TCL集团有限公司)；电热恒温水浴锅(HH﹒SY21-Ni6，北京长源实验设备厂)；超声波清洗器(SG2200HE，上海冠特超声仪器公司)；电热鼓风干燥箱(GZX-9140MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；其他为一般常规仪器。

1.1.3 试药。无水三氯化铝，AR，天津市大茂化学试剂厂；纯化水，贵州省生化工程中心自制；芦丁为对照品(批号R-5143，纯度>95%)，购自Sigma公司；其他试剂均为AR。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品4 mg，加入至10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，配成芦丁含量0.4 mg/ml的对照品溶液，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备。

1.2.2.1 样液制备。精密称取0.10 g鱼胆草样粉，加入90%乙醇10 ml，密封后于70 ℃水浴加热提取2 h，取出冷却后过滤，即得。

1.2.2.2 空白对照液制备。精密吸取90%乙醇0.5 ml，置于10 ml的容量瓶中，用1% AlCl3溶液定容，摇匀显色后备用。

1.2.3 方法学考察。

1.2.3.1 线性关系考察。分别精密吸取对照品溶液0.125、0.250、0.375、0.500、0.625 ml，置10 ml的容量瓶，并用1% AlCl3溶液定容，摇匀，放置10 min后，以1% AlCl3溶液为空白，采用紫外-可见分光光度法，在420 nm波长处测定吸光度。以芦丁对照品浓度为横坐标(X)、溶液吸光度值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.3.2 精密度试验。精密量取芦丁对照品溶液0.25 ml，按“1.2.1”方法制备对照品溶液，于420 nm处连续测定6次，并计算吸光度的RSD。

1.2.3.3 稳定性试验。精密吸取样品溶液0.5 ml，按“1.2.2.1”方法制备供试液，分别在420 nm处于0、10、20、30、40、50、90、120 min时测定吸光度，并计算吸光度的RSD。

1.2.3.4 重复性试验。取同一批样品粉末0.10 g，按“1.2.2.1”方法制备供试液，平行制备6份，按样品测定方法平行测定，计算总黄酮平均含量和RSD。

1.2.3.5 加样回收试验。精密量取“1.2.2.1”供试品6份，分别量取1.0 ml，分别加入芦丁对照品溶液0.16、0.20、0.24 ml，按标准曲线绘制的测定方法，分别在420 nm处测定吸光度值，计算加样回收率和RSD。

1.2.4 样品的含量测定。将供试液于紫外分光光度仪420 nm处测定吸光度值，根据标准曲线，计算所取样品溶液中总黄酮的百分含量。计算公式为：样品中总黄酮的含量=(样品黄酮浓度×提取液总体积)/样品重量×100%。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系的考察。按“1.2.3.1”方法操作，记录吸光度值，以样品浓度X(mg/ml)为横坐标、吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得线性回归方程为Y=35.16X+0.014 3(r=0.999 3)，表明芦丁对照品溶液在0.005～0.025 mg/ml范围与溶液的吸光度之间呈良好的线性关系。

2.1.2 精密度试验。按“1.2.3.2”方法操作，芦丁对照品溶液RSD=0.390%(n=6)，表明在此试验条件下精密度良好。

2.1.3 稳定性试验。按“1.2.3.3”方法操作，计算得出供试品溶液吸光度RSD=0.430%(n=6)，表明供试品溶液在120 min内基本稳定。

2.1.4 重复性试验。按“1.2.3.4”方法操作，计算得鱼胆草中总黄酮平均含量为2.662%，RSD=1.500%，表明该方法测定样品重复性良好。

2.1.5 加样回收试验。由表1可见，样品平均回收率为101.69%，RSD=2.21%(n=6)，表明该方法准确、可靠，符合相关要求，可用于鱼胆草中总黄酮的含量测定。

2.2 鱼胆草中总黄酮含量 经测定，鱼胆草中总黄酮平均含量为2.510%，RSD=0.054%。

2.3 鱼胆草不同部位中总黄酮含量 精确称取鱼胆草根、茎、叶样按“1.2.2.1”方法制备供试液，进行测定，结果显示，鱼胆草根、茎、叶中总黄酮含量分布为叶>根>茎，即叶子中总黄酮含量最高，为2.542%。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

3 结论与讨论

3.1 提取方法的筛选 精密称取约0.10 g鱼胆草样粉10份，每平行2份分别加入水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇10 ml，按“1.2.2.1”方法制备供试液，并于紫外分光光度仪420 nm处测定吸光度值，并计算其黄酮含量。由图1可知，提取液分别为水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇时，测得的总黄酮含量呈递增趋势，其中以90%乙醇为提取液时，总黄酮含量最高(2.25%)，但其含量仍低于加热提取的方法，故供试品采用了一定梯度乙醇超声及70 ℃加热2 h的提取方法。

3.2 显色时间的确定 精密称取0.10 g鱼胆草样粉，加入90%乙醇10 ml，密封后于70 ℃水浴加热提取2 h，取出冷却后过滤，精密吸取样液0.5 ml，置于10 ml的容量瓶中，用1%AlCl3溶液定容，摇匀分别显色15、30、45、60 min后测定其420 nm吸光度值。由表2可知，鱼胆草供试液样品于60 min显色时间内稳定性良好。

表2 不同显色时间对鱼胆草总黄酮含量的影响(n=3) %

3.3 显色剂的选择 用AlCl3溶液作为黄酮类比色测定的，主要是黄酮母核中含有碱性氧原子，一般又多带酚羟基，能和铝离子产生鲜黄色络合物，显色反应比较稳定。

3.4 结论 该研究结果表明，采用紫外分光光度法测定鱼胆草中总黄酮含量，在0.005～0.025 mg/ml范围内与溶液的吸光度之间呈良好的线性关系(r=0.999 3)，平均回收率为101.69%，RSD为2.21%(n=6)，鱼胆草中总黄酮的含量为2.510%；鱼胆草的不同部位根、茎、叶中，叶子中总黄酮的含量最高。该研究建立的测定鱼胆草中总黄酮含量的方法简单快捷、分离度好。

[1] NATIO T，KUBOTA K，SHIMODS Y, et al.Effects of constituents in a Chinese crude drug, ligusticum Chuanxiong rhizome on casocontraction and blood viscosity [J].Nat Med,1995,49:288-290.

[2] 黄衡宇,李鹏,陈义光.鱼胆草的自然资源初步研究[J].中草药，2002(5):466-468.

[3] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(下册)[G].2版.北京：人民卫生出版社，1996.

[4] 彭买姣,夏新华,颜红，等.正交试验设计优选鱼胆草提取工艺研究[J].中南药学，2013,11(4)：252-254.

[5] 曹纬国，刘点勤，邵云，等．黄酮类化合物药理作用的研究进展[J]．西北植物学报，2003,23(12)：2241-2247.

[6] 田洪，潘善庆.鱼胆草的解热抑菌消炎作用研究[J].中药新药与临床药理，2006,17(5):346-347,350.

[7] 郭爱华，龙胆科獐牙菜属药用植物化学成分和药理作用的研究进展[J].山西中医学院学报，2005，6(1)：57-59．

Determination of Total Flavonoids Content inSwertiadavidiiFranch by UV Spectrophotometry Method

MA Hai-xia1, HE Jun2*, YANG Fu-ming3

(1.College of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 2.Research Center of Biochemistry Engineering of Guizhou Province, Guiyang, Guizhou 550025)

[Objective] To establish the method for determining total flavonoids content inSwertiadavidiiFranch.[Method] UV spectrophotometry was adopted to determine the content of total flavonoids, using the AlCl3coloration method with rutin reference to measure at 420 nm wavelengths.[Result] The results showed that in the rage of 0.005-0.025 mg/ml, the excellent liner relationship was obtained with coefficient of 0.999 3, the average recovery rate of 101.69%, theRSDof 2.21%, and the total flavonoids content inSwertiadavidiiFranch was 2.510%.The total flavonoids content in the leaf of the Swertia davidii Franch was 2.542%.[Conclusion] Ultraviolet spectrophotometry is simple, accurate and reliable for determining total flavonoids content inSwertiadavidiiFranch.

SwertiadavidiiFranch; Total flavonoids;Different parts; Content determination; Ultraviolet spectrophotometry

贵州大学研究生创新基金(研农2015019)。

马海霞(1989- )，女，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向：天然药物成分及生理活性。*通讯作者，副教授，硕士，硕士生导师，从事中药活性成分研究。

2015-04-23

S 567

A

0517-6611(2015)17-093-02