水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

谌 鑫， 王春台， 覃永华

(中南民族大学生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北武汉 430074)



水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

谌 鑫， 王春台， 覃永华*

(中南民族大学生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北武汉 430074)

[目的]构建水稻基因OsVDAC5的RNAi表达载体，遗传转化获得OsVDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法] 通过PCR扩增OsVDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体pMCG161，以水稻日本晴为受体，将OsVDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化，利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中OsVDAC5的表达水平。[结果]OsVDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻OsVDAC5基因功能提供了重要材料。

水稻；OsVDAC5基因；干涉载体；构建；遗传转化

电压依赖性离子通道蛋白(Voltage-Dependent Anion Channel VDAC)是一种多基因家族编码的定位于线粒体外膜的离子孔道蛋白，并能同定位在线粒体外膜上的其他蛋白形成复合物，主要功能是介导代谢物在细胞质和线粒体之间的运输[1]。VDAC作为代谢分子进出线粒体的门户，控制着线粒体与细胞其他结构之间的联系，同时VDAC在线粒体介导的细胞凋亡中也起着重要作用[2]。

VDAC基因在植物生长发育及逆境胁迫应答中扮演着重要角色[3]。拟南芥中的4个VDAC基因在高盐胁迫下，表达量明显下调，但冷胁迫和干旱胁迫对它们的表达没有影响[4]。然而，抑制拟南芥中VDAC2的表达，直接导致幼苗对脱落酸无敏感性，使植株失去应答盐胁迫和干旱胁迫的能力[5]。当水稻经过渗透胁迫、盐胁迫和干旱胁迫后，其VDACs的表达量明显上升[6]。Desai等[7]研究发现珍珠栗中的PgVDAC虽然是盐诱导基因，但在干旱、冷和水杨酸的胁迫下，表达量也明显上调，提高了植株在胁迫环境下的应答能力。Chika等发现敲除拟南芥中的VDAC2和VDAC4基因导致植株生长缓慢，花粉育性降低。该研究还发现，VDAC1是植株生长发育必须的，且参与植株抗病过程。同时VDAC作为HR反应的标志基因之一，参与拟南芥细胞中的抗病反应[8]。敲除VDAC1的拟南芥缺陷型植株，在感染病毒avrRpt2后，感病性明显升高，最终导致HR诱导的细胞死亡途径被抑制[9]。烟草中的3个VDAC基因在接种非宿主型病原后，表达量明显上升[9]，且烟草中超表达VDAC会直接导致植株叶片中H2O2的产生，调节植物的抗病反应[10]。已有研究表明，水稻中存在8个VDAC基因[11]，且发现这8个VDAC基因在水稻中均为组成型表达[12]。超表达水稻VDAC4基因导致感染了病毒性病原的烟草BY2细胞和本萨明那烟叶片细胞死亡，表明VDACs调节活性氧的产生以应答病原感染[13]。

笔者以表达载体pMCG161为基础构建了OsVDAC5基因的干涉载体，以水稻日本晴为转化受体，通过农杆菌介导的遗传转化得到OsVDAC5表达下调的转基因植株来研究OsVDAC5基因的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 生物材料。水稻日本晴( Nipponbare) 、大肠杆菌DH5α感受态细胞和农杆菌EHA105感受态细胞及表达载体pMCG161(图1)由中南民族大学生物技术国家民委重点实验室提供。

1.1.2 试剂。DNA聚合酶(rTaq)、dNTP、DNA Marker、T4连接酶、限制性内切酶均购自TaKaRa公司，总RNA提取试剂Ttizol购自Invitrogen公司,反转录试剂盒Rever Tra Ace-α-TM、荧光定量试剂盒SYBR Green-Realtime PCR Master Mix QPK-201购自TOYOBO公司，DNA 凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.3 仪器。TFL-40Gel Vue UV Transilluminator凝胶成像系统，SYNOPTICS LTD(英国)；centrifuge 5810R离心机，Eppendorf(德国)；CR22G高速离心机，Hitachi(日本)；PTC-200 PCR仪，Bio-Rad laboratories MJ Reasearch(美国)；7500 Fast Real-time PCR仪，Applied Biosystems(美国)；HQ45Z恒温摇床，武汉中科科仪技术发展责任有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计。在OsVDAC5基因mRNA序列中选取一段特异序列作为干涉区段(300～500 bp)，在正向引物5′端加上TAA ACTAGT GGTACC (SpeΙ和KpnΙ位点)序列，反向引物5′端加上TAA GAGCTC GGATCC (SacΙ和BamHΙ位点)序列。根据pMCG161载体序列设计2对鉴定引物PMCGF/PMCGR(5′-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3′/5′- GCCTAACCAAACATAACGAACG-3′)和PMCG2F/PMCG2R(5′- GGCTCACCAAACCTTAAACAA -3′/5′- CTGAGCTACACATGCTCAGGTT -3′)，分别检测干涉载体中和转化植株中插入的第一链和第二链。同时，根据基因riceActin1gene(accession no.AK060893)设计一对特异引物actinF/actinR(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCA-3′，反向5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTC-3′)，用于转基因植株cDNA的检测。引物用Primer3(v.0.4.0)在线设计。

1.2.2 RNAi植物表达载体的构建。以日本晴幼穗的单链cDNA为模板，用特异引物进行PCR扩增，切胶回收目的片段，用KpnΙ和BamHΙ同时双酶切该目的片段和空载pMCG161，用T4连接酶将两者连接后热激转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆培养后提取质粒DNA进行PCR和双酶切检测。再将目的片段和中间载体用SpeΙ和SacΙ双酶切后，用T4连接酶连接后热激转化大肠杆菌DH5α，PCR检测为阳性克隆进行测序。测序正确的质粒电激转化农杆菌EHA105感受态细胞，挑取单克隆进行PCR检测。

1.2.3 水稻的遗传转化。利用农杆菌介导遗传转化，将成熟日本晴种子诱导愈伤后继代培养，用农杆菌侵染胚性愈伤，共培养2～3 d后，用潮霉素进行抗性愈伤的筛选、分化、生根培养，待植株根系发达后打开瓶口加入一定量的无菌水进行炼苗，约7 d后移栽到实验田。

1.2.4 转基因植株的阳性鉴定。采用CTAB法提取转基因植株的基因组DNA，用引物PMCGF/R和PMCG2F/2R进行PCR检测。取4 μl产物点用检测。

1.2.5 RT-PCR检测阳性植株的表达量。采用Trizol法提取转基因植株的总RNA，利用TOYOBO Rever Tra Ace-α-TM试剂盒将其反转录成cDNA。用内参Actin1引物对cDNA模板进行PCR鉴定，按一定比例稀释后用设计的OsVDAC5基因的RT-PCR引物和actin引物同时对cDNA模板进行RT-PCR。

2 结果与分析

2.1 干涉表达载体的构建

2.1.1 目的片段的克隆。通过PCR扩增出目的片段，切胶回收后进行电泳检测，获得大小约为400 bp的条带(图 2)，测序结果显示目的条带正确。

2.1.2 重组质粒的鉴定。利用引物PMCGF/R和PMCG2F/2R对构建的OsVDAC5干涉载体进行PCR鉴定(图3)，获得的条带同目标带一致，同时测序结果显示正确。

2.2 遗传转化与转基因植株T0代鉴定 构建好的干涉载体通过电激转化到农杆菌EHA105感受态细胞，通过农杆菌介导法侵染日本晴的愈伤组织，经过筛选、分化、生根、炼苗，然后种植于田间(图4)。

取5 cm左右的幼嫩叶片，以CTAB法提取的基因组DNA为模板，用引物PMCGF/R和PMCG2F/2R对转基因植株进行PCR鉴定(图5)，共获得21株转基因阳性植株。

2.3 阳性植株的表达量检测 取5 cm左右的叶片用Trizol试剂提取其总RNA，电泳可见清晰的3条主带，转基因植株RNA提取成功(图6)。利用TOYOBO Rever Tra Ace-α-TM试剂盒将其反转录成cDNA,用内参actin引物对cDNA模板进行PCR鉴定，结果表明，cDNA模板质量良好(图7)，可用于后续的RT-PCR检测。按一定比例稀释cDNA模板，用设计的RT-PCR引物OsVDAC5(F、R)和Actin1引物同时对cDNA模板进行RT-PCR。结果显示，相比野生型日本晴(Nipponbare)，所有阳性植株中OsVDAC5基因的表达水平均有不同程度的显著下调(图8)，仅v5-3和v5-5植株中OsVDAC5的表达量相对较高，表明基因OsVDAC5的表达在阳性植株中被抑制，可作为下一步转基因植株功能分析的材料。

3 讨论

该试验成功构建了基因OsVDAC5的干涉表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化获得了多株T0代转基因植株，并对这些转基因植株进行阳性鉴定和RNA水平的表达量分析。结果表明，基因OsVDAC5在转基因植株中表达量显著下调，基因OsVDAC5干涉植株的获得为该基因的后续深入研究提供了材料和基础。试验过程中发现转基因阳性植株在花粉育性和株高方面，相比野生型日本晴植株有明显降低的趋势，暗示抑制OsVDAC5基因的表达可能会对水稻发育造成一定影响，这些表型的确定还需要进一步深入鉴定。

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[2] 郭文静,谭艳平,刘学群,等.水稻osvdac7 干涉载体的构建及转基因植株的表达[J].生物技术,2013(5):4.

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Construction and Genetic Transformation of RNAi Vector ofOsVDAC5 Gene in Rice

KAN Xin, WANG Chun-tai, QIN Yong-hua*

(School of Life Sciences, South-central University for Nationalities,Hubei Provincial Key Laboratory of Plant Germplasm Resources Protection and Utilization in Wuling Mountainous Areas, Wuhan, Hubei 430074)

[Objective]To construct and transform the expression vector for RNA interference of riceOsVDAC5 gene, and to obtain transgenic plants in which the expression level ofOsVDAC5 was down-regulated for research the biological function ofOsVDAC5. [Method] RNAi-special sequence ofOsVDAC5 gene was cloned into the plant expression vector pMCG161, and transformed into callus of rice Nipponbare mediated by Agrobacterium. Further, the expression level ofOsVDAC5 in T0generation transgenic plant was checked by PCR and RT-PCR. [Result] The results showed that the expression level ofOsVDAC5 in RNAi-transgenic plants was down-regulated obviously. [Conclusion] The study can provide important materials for further research of geneOsVDAC5.

Rice;OsVDAC5 gene; RNAi vector; Construction; Genetic transformation

国家自然科学基金项目(31170226)。

谌鑫 (1987- )，男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：遗传学。*通讯作者，讲师，博士，从事水稻逆境分子生物学研究。

2015-04-24

S 188+.1

A

0517-6611(2015)17-017-03