植物MicroRNA研究进展

郑海泽，张红芳

(山西省农业科学院小麦研究所，山西 临汾 041000)

植物MicroRNA研究进展

郑海泽，张红芳

(山西省农业科学院小麦研究所，山西 临汾 041000)

MicroRNA，简称miRNA，是一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码小分子RNA，在生物发育过程中起着重要作用。笔者详细介绍了植物miRNA的发现与形成过程，包括转录、加工成熟及功能复合体装配3个主要步骤。分析了miRNA在植物生长发育、胁迫适应及自身形成途径三方面的调控作用。

植物MicroRNA;MicroRNA的形成;调控机制

MicroRNA，简称miRNA，是一类长度约为22个核苷酸(nucleotide，nt)的内源单链非编码小分子RNA［1］.1993年，Lee等［2］在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了第1个能阶段性调控胚胎后期发育的内源性小分子 RNA-lin-4，揭开了miRNA研究的序幕。7 a后，Reinhart等［3］在线虫中又发现了第2个调控时序性发育的小分子RNA-let-7.lin-4和let-7长度都约为22 nt，作用时间也是暂时性的。所以，当时被命名为小分子时序 RNA (small temporal RNA，stRNA).2001年，来自美、德等国的3个不同研究小组通过大规模的克隆和功能研究，发现生物体内存在着大量类似的小分子RNA，并将它们统一命名为miRNA［4-6］.在最新的miRBase登记的miRNA数据库中，人类、小鼠、拟南芥和水稻分别含有985，767，215和452种miRNA.

miRNA等调控小分子RNA的发现，使人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识。这类调控小RNA在生物体内以崭新的层面控制着基因表达过程，在发育、细胞增殖、凋亡、抵御环境胁迫等诸多方面发挥重要作用［7］。从目前所积累的实验证据可以肯定，miRNA等小分子RNA涉及到了整个细胞水平的几乎所有事件。

1 植物miRNA的形成过程

miRNA并不是由基因组直接转录出来，它在生物体内的产生是一个逐步的过程，包括转录、加工成熟及功能复合体装配3个主要步骤。

1.1 miRNA初级转录本的形成

通常位于蛋白编码基因间区域的植物内源miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录产生含有茎环结构的miRNA初级转录本(pri-miRNA)。

1.2 miRNA加工

DCL1(一种RNaseⅢ家族的Dicer同源物)在细胞核内切割pri-miRNA茎环结构中远离或靠近环端的双链位点，释放出大小约为70 bp～300 bp的miRNA前体(pre-miRNA)。此过程还需要双链RNA结合蛋白HYPONASTIC LEAVES 1(HYL1)和C2H2锌指蛋白SERRATE(SE)的协助，它们在细胞核的加工中心D-body中与DCL1相互作用，共同行使功能［8］。随后DCL1在细胞核内对pre-miRNA进行第2步切割，形成1个具有不完全配对的小分子双链RNA复合体。此复合体既包含了成熟的miRNA链，也包含了源于pre-miRNA且与成熟miRNA配对的反义链，称为miRNA*链［7］。

1.3 miRNA功能复合体装配

miRNA:miRNA*互补双链在甲基转移酶Hua Enhancer 1(HEN1)的作用下3'末端的核苷酸甲基化［9］，同时在Exportin-5的同源物HASTY(HST)的作用下运出细胞核，转移到RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中。RISC复合体蛋白中含有Argonaute(AGO)和RNA解旋酶，miRNA:miRNA*互补双链中的一条单链可以选择性结合到RISC上成为成熟miRNA，而另一条单链则被立即降解。

2 植物miRNA的作用机制

miRNA通过对靶mRNA直接切割或者翻译抑制这两种作用机制来负调控靶基因的表达。理想的植物miRNA靶标与miRNA之间互补错配数一般不超过3个，且第10，11位碱基不允许有错配，因为切点的位置恰好位于该位置之间。靶mRNA被miRNA介导切割之后，其较为稳定的3'切割产物可以通过5'-RACE的方法得到，从而精确定位mRNA的切割位点。

最近的研究表明，植物miRNA不仅能切割靶mRNA，也能抑制翻译。最早发现的典型个例是拟南芥的miR172，它与靶标基因APETALA2(AP2)的作用位点位于该基因编码区，除有1个碱基的差异外，其它碱基完全互补。但在拟南芥花的发育过程中，miR172介导对靶基因的翻译抑制，而不是直接切割调控［6］。miR172并不是植物miRNA中的一个特例，近来Voinnet研究小组通过遗传学手段筛选出拟南芥中一系列miRNA活性缺陷(miRNA-action deficient，mad)突变体，发现大多数miRNA都具有切割靶标和翻译抑制两种作用机制，并且切割与抑制机制是协同进行的。对靶mRNA进行Northern杂交分析，大多数情况下既能检测到未被切割的靶mRNA，也能检测到较小的切割产物，表明植物miRNA一方面可以切割靶标，另一方面可以对于未被切割的靶mRNA进行翻译抑制，最终的蛋白水平抑制效果是两种作用的综合，解释了为什么以前发现miRNA对靶标蛋白水平抑制效果要高于转录水平［9］。miRNA和靶标的作用位点无论是在编码区，还是在3'或5'UTR区，似乎并不影响靶标切割和翻译抑制这两种相互作用的强弱。

3 植物miRNA的生理功能

3.1 调控植物生长发育

对植物miRNA在生长发育过程中的调控作用已有大量深入的研究报道，这是因为相当一部分miRNA的靶标是在植物生长发育或细胞分化过程中起重要作用的转录因子。如，miR165/166通过调节3个同型亮氨酸拉链结构域(homeodomain leucine zipper，HD-Zip)转录因子PHB/PHV/REV的表达，决定叶子近轴与离轴细胞的分化方向。如果这3个基因与miR165/166的作用区域发生突变从而逃脱miR165/166的调控，那么突变体植株叶的极性会出现缺陷。研究人员通过正向遗传学的方法在拟南芥中找到了编码miR319的JAW基因，该基因突变的植株在叶片形状和曲率方面都极不均匀，表明miR319可以通过降解TCP类转录因子家族的mRNA来调控拟南芥叶子的生长发育［10］。miR164的靶标是NAC类转录因子家族，包括CUC1和CUC2等，在miR164表达受到抑制的突变体中，花瓣的数量较野生型明显增多，提示miR164通过调节转录因子CUC1和CUC2等的表达水平来控制花瓣的数量。最近的研究发现，miR164还能调控与植物叶片衰老相关的转录因子ORE1，过表达miR164的转基因拟南芥植株叶片衰老过程被明显延缓［13］。可以说，植物miRNA几乎参与调控植物所有重要的发育过程，包括叶的发育、器官极性、花的形态建成、开花时间、auxin信号传导等。

3.2 调控植物适应环境胁迫

1)适应营养缺乏环境。在土壤或者含2 mM SO42-培养基中生长的拟南芥中，miR395的表达水平很低，用Northern杂交几乎检测不到。而当培养基中SO42-浓度从0.2 mM降低到0.02 mM时，miR395的表达量迅速升高，导致了靶基因APS量的降低。由于APS编码ATP硫酸化酶，用来催化无机硫酸盐消化的第一步反应，在低硫酸盐环境中它的表达被miR395所下调，体现了植物对低硫酸盐环境的适应［14］。另外一个类似的例子是拟南芥的miR399，它在正常生长环境下几乎不表达，而在缺乏无机磷酸盐环境中受到诱导，引起靶基因UBC表达量下降。UBC编码一个泛素结合酶，它能够使磷转运蛋白AtPT1泛素化而降解。因此，UBC表达量下降会导致AtPT1的增加，从而有利于植物积累更多的磷酸盐来应对磷元素缺乏。

2)应对氧化胁迫。拟南芥miR398的靶标是2个CSD基因，均编码铜/锌超氧化物歧化酶，能将超氧阴离子转化成过氧化氢(H2O2)，在清除活性氧(ROS)自由基过程中起关键作用［11-12］。拟南芥植株在高强度光照、重金属和甲基木精等氧化胁迫处理条件下，miR398的表达受到抑制，而CSD的表达明显上升。过量表达miR398抗性形式的CSD基因能使转基因植株提高对于氧化胁迫的耐受性。

3)其它非生物胁迫方面。低温、干旱、高盐［7］、紫外辐射［8］和机械损伤［15］等胁迫条件都会引起植物体内多种miRNA表达量的变化，暗示miRNA可能参与多种非生物胁迫的应答。

4)生物胁迫方面。拟南芥的miR393能通过负调控靶基因TIR1，AFB(均为auxin受体)表达，从而抑制auxin信号通路介导植株抗细菌抗性，过表达miR393能提高植株抵御细菌生长的能力。

植物miRNA还参与了自身形成途径的调控。在植物体内，miRNA的表达必须受到精确的调控。因为细微的表达量差异也可能会引起一系列连锁反应，从而改变植物的生理状态。因此，在植物miRNA的形成过程中，每一个过程都会受到严格的调控，比如，miRNA基因的转录、DCL1的加工、RISC中的装配等等。研究发现，植物miRNA形成过程中2个关键的基因DCL1和AGO1分别受到miR162和miR168的调控。DCL1参与了 miR162的产生，miR162则介导了DCL1的反馈调节;AGO1能稳定miR168，miR168与 AGO1结合后又能切割 AGO1 mRNA.miR162/DCL1和miR168/AGO1这种相互紧密调节方式确保了它们在体内处于动态平衡［9］。

4 展望

miRNA的发现，是RNA研究领域的重要突破，为人们提供了一种全新的视角来认识生物基因和基因表达调节的本质。在利用传统方法研究基因时，注意力不能再仅仅局限在蛋白质和基因上面，对植物miRNA调控基因的错综复杂网络目前有了一定的认识。就阐明miRNA与基因调控网络来说，还需进一步详细的了解。随着研究的深入，miRNA将在生命起源和早期进化、基因复杂性等发育过程中产生更为重要的影响，将人类对自然的认识提高到新的高度。

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Research Progress on MicroRNA in Plants

Zheng Haize，Zhang Hongfang
(Wheat Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Linfen 041000，China)

MicroRNA(miRNA)is small RNA of 22 nucleotides(nt)in length that play important roles in regulating gene expression and biological processes.This review tried to have a brief introduction on the progresses of miRNA discovery and formation，including three steps of transcription，assemble processing and function complex processing.Regulating effect of miRNA in growth and development，stress adaption，its formation ways was analyzed.

MicroRNA in plant;MicroRNA formation;Regulatory mechanism

Q943

A

1007-726X(2015)03-0037-03

2015-07-01

山西省科技攻关项目(20150311001-5)

郑海泽(1964— )，男，山西襄汾人，1986年毕业于山西农业大学，副研究员。