大蒜素抗运动性氧应激和DNA损伤的作用研究

苏美华　杨多多　许庆忠

摘要：目的：观察补充大蒜素对人体力竭运动后外周血细胞DNA的损伤效应及血清中SOD、GSH和MDA活性的影响，探讨大蒜素抗DNA氧化损伤的作用机制。方法：选取16名健康男运动员（年龄21.06±1.02岁），随机分为两组包括对照组8名（C组，补充淀粉安慰剂胶囊）和实验组8名（T组，补充大蒜素胶囊），运动前14天各组每天分别口服安慰剂和大蒜素胶囊，补剂后所有被试均参加Bruce力竭运动方案，并分别在补剂前、补剂后和运动后即刻这三个阶段对两组受试者进行采血抗凝，采用单细胞凝胶电泳（SCGE）技术检测人体外周血细胞DNA损伤情况，并测定血浆中超氧化物岐化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量。结果：补剂前和补剂后，对照组和实验组的DNA损伤水平与氧化应激水平无显著性差异（P>0.05）；运动后即刻实验组运动员外周血细胞的DNA损伤水平显著低于对照组力竭运动后的水平，其MDA水平、SOD和GSH含量较力竭对照组亦出现显著降低（P<0.001， P<0.05， P<0.05）；而对照组运动后即刻SOD、GSH和 MDA水平较运动前均出现显著上升，DNA损伤值明显加剧（P<0.001）。结论：力竭运动可诱导人体外周血细胞DNA损伤值增加及脂质过氧化产物MDA水平的升高，介导SOD和GSH抗氧化酶活性的过量表达，大蒜素能够提高机体抗氧化能力，降低自由基水平，减轻和预防运动性氧应激所致的DNA损伤。

关键词：大蒜素；DNA损伤；氧化应激；力竭运动

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2014）06-0087-05

Abstract：Objective：This study was performed to determine the effect of allicin against DNA damage and oxidative stress on human peripheral blood cell after exhaustive exercise， and discuss the protective mechanism of allicin. Methods：16 male athletes （aged 21.06±1.02 years）， in a randomized and double-blind design were allocated in two equal supplement and placebo groups （80mg/day allicin for 14 days）. After supplementation， all participants were participated in Bruce test. The blood samples were taken in three phases （before and after the supplementation and after the exercise）. The DNA damage was investigated on human peripheral blood cell by using the single cell gel

收稿日期：2014-09-20

基金项目：福建省自然基金青年项目（2013J05055），福建省教育厅A类项目（JA13199）。

作者简介：苏美华（1983-），女，福建泉州人，博士，讲师，研究方向运动生理与体育健康促进。

作者单位：1.闽南师范大学体育学院，福建 漳州3630001；2.毕节学院体育与健康科学学院，贵州 毕节551700

1. School of Physical Education， Minnan Normal University， Zhangzhou 363000， Fujian， China；2. College of P. E. and Health Sciences， Bijie University， Bijie 551700， Guizhou， Chinaelectrophoresis （SCGE） and the level of SOD， GSH and MDA was detected in serum.Results：During the first two phases（before and after the supplementation）， the level of DNA damage and the status of SOD，GSH and MDA between supplement and placebo groups did not show significant difference（P>0.05）. Moreover， exercise-induced decrease of DNA damage and the level of SOD， GSH and MDA in the supplement group were significantly more in comparison with those in the placebo group （P<0.001），instead，the DNA damage and the level of SOD， GSH and MDA increased significantly after exercise. Conclusions： The exhaustive exercise could result in the DNA damage on human peripheral blood cell and induce high level of oxidative stress. However， the allicin could reduce free radicals and prevent DNA damage from oxidative stress induced by exhaustive exercise.

Key words：allicin； DNA damage； oxidative stress； exhaustive exercise

大蒜是食药两用的蔬菜之一，也是日常饮食中的重要调味品。中医认为其具有“除寒湿、辟阴邪、袪毒气、破恶血、消痛肿、化肉食”之功效。大蒜素则是从大蒜中提取出来的一种有效成分，其主要成分的化学名称为二烯丙基二硫醚。现代研究发现，大蒜素具有很高的营养和药用价值，特别是大蒜素具有降血脂、降血压、保护血管、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤、抗病菌等作用，并能清除自由基，抗脂质过氧化减轻活性氧对机体造成的氧化损伤[1-3]。大强度耐力运动可引起体内过量自由基产生及氧化应激，并对机体产生一系列危害[4-5]。动物实验已经证明过量运动可诱发心肌、血细胞的DNA损伤[6]。但目前关于大蒜素对剧烈运动引起机体组织DNA损伤所具有的保护效应如何，其相关研究报道还较少，而运动补剂和营养干预对于提高运动成绩和促进体能康复具有重要的作用，也是运动医学领域研究的热点。为此，本研究拟采用单细胞凝胶电泳技术（single cell gel electrophoresis， SCGE）[7]，检测力竭运动后人体外周血细胞的DNA损伤情况，通过补充大蒜素观察其对人体外周血细胞DNA损伤的保护作用和抗氧化效应，并探讨其作用机制，为运动疲劳的预防与消除提供一种新方法，为开发具有抗氧化活性的保健食品提供实验和理论依据。

山东体育学院学报第30卷第6期2014年12月 苏美华，等大蒜素抗运动性氧应激和DNA损伤的作用研究No.6 20141研究对象与方法

1.1研究对象

选取闽南师范大学体育学院体育专业男生16名，随机分为两组包括实验组8名（T组，补充大蒜素胶囊）和对照组8名（C组，补充淀粉安慰剂胶囊），均无吸烟史，体检健康状态良好，自愿参与此次实验，实验期间遵守规律的合理膳食。

1.2研究方法

1.2.1运动方案

受试者在Lode Valiant 医用电动跑台上采用Bruce方案[8]进行力竭运动。力竭标准为：1）受试者经再三鼓励，也无法保持该运动强度；2）运动过程中心率达到180次/min以上；3）RPE数值达到19或20。

1.2.2血样采集及服用补剂方法

对照组受试对象从运动前2 周开始每天口服安慰剂，剂量为每天80 mg；实验组受试对象同时间每天口服大蒜素胶囊，剂量为每天80 mg[9]。实验的第一天，对所有被试进行身高、体重和体成分的测定；在补剂之前、补剂第14天、第15天运动后即刻分别采集两组受试者外周静脉血1 mL，放入含有0.1 mg肝素的抗凝管，取每个被试抗凝血10～15 μL用于SCGE检测，余下的抗凝血立即冷冻离心后用于抗氧化酶与脂质过氧化水平的测定。

1.2.3血细胞DNA损伤检测

胶片制作参照Hartmann[10]的方法稍加改进。将制好的载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液约覆过胶面0.25 cm左右，解旋20 min，以便使DNA解螺旋成单链，使DNA断片在电泳场中易于迁移。解旋后在25 V、250 mA的条件下电泳30 min。停止电泳后小心地将玻片放入中和缓冲液中中和15 min。取出玻片，滴加30～50 μL 浓度为5μg/ mL的EB染液到胶体表面，盖上盖玻片，染色15～20 min后荧光显微镜观察。

1.2.4抗氧化酶与脂质过氧化水平的测定

SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA测定采用硫代巴比妥酸比色法，GSH测定采用比色定量法。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3主要仪器和试剂

DYY-6C型三恒电泳仪和DYZC-24B型电泳槽（北京，六一）；BX-51型荧光显微镜和E-330型数码像机（OLYMPUS）；721可见光分光光度计；ECOM-F6124型半自动生化分析仪。肝素抗凝剂、低熔点琼脂糖（LMA）、正常熔点琼脂糖（NMA）、肌氨酸钠、Triton X -100二甲基亚砜（DMSO）及溴化已锭（EB）等均购自Amresco公司；大蒜素胶囊购于江苏正大清江制药有限公司（国药准字H32025683），其它试剂均为优级分析纯。

1.4统计分析

荧光显微镜下用515～560 nm 的激发光观察，在200 ×下，每张涂片上随机观察5个视野，每个视野多于5个细胞，每组6张载波片。用IMI1.0（深圳良正软件开发有限公司）彗星分析软件测定彗星长、尾长、尾部DNA百分数、彗星分布矩、尾惯量、Olive尾矩等指标， 用EXCELL和SPSS软件对所获得数据进行正态检验（1-Sample K-S）和单因数方差分析（One-Way ANOVA），结果以mean±SD表示。P< 0.05表示组间差异显著性。

2结果

2.1受试者身体形态指标简况

受试者的基本情况见表1，对照组和实验组受试者身体特征基本一致，表现在身体形态指标身高、体重、BMI值、体脂百分比无显著差异，而对照组和实验组在各自补充补剂后，实验组补充大蒜素后力竭时间显著长于对照组（P< 0.01）。表1受试者基本情况一览表

组别年龄身高（cm）体重（kg）BMI 体脂%力竭时间（min）对照组21.37±1.06172.3±1.6664.87±2.1021.78±0.9813.98±2.4315.87±1.12实验组20.75±1.03172.25±1.8365.37±1.8321.69±0.5114.03±1.3816.87±0.83**注：与对照组相比，**P<0.01。

2.2服用大蒜素前后对人体外周血细胞DNA损伤的形态学观察

染色后的涂片在荧光显微镜下观察发现，补剂前安静状态下对照组和实验组运动员外周血细胞绝大部分表现为一圆形荧光团，荧光强度均匀，边缘光滑，即彗星头部，无明显拖尾现象（图A1和A2）；对照组和实验组连续14天服用补剂后，安静状态下运动员外周血细胞绝大部分也表现为一圆形荧光团，荧光强度均匀，边缘光滑，即彗星头部，无明显拖尾现象（图B1和B2）；实验组在进行Bruce力竭运动方案后即刻，运动员外周血细胞尾部的荧光强度增强，只有部分细胞出现“彗星尾”， “彗星尾”尾长并无明显加长 （图C1） ；而对照组在进行Bruce力竭运动方案后即刻，运动员外周血细胞尾部的荧光强度增强，“彗星”尾部逐渐变长变大，彗星头部的直径随着尾部的加长而减小，彗星样细胞的出现率明显升高 （图C2）。

图1服用大蒜素后运动员

外周血细胞DNA彗星图（×100）2.3服用大蒜素后人体外周血细胞DNA损伤的SCGE检测指标变化情况

彗星图像用彗星分析软件并选取国际通用指标[7，10]尾长、尾分布矩和Olive尾矩等指标进行分析的结果见表2。补剂前安静状态下对照组和实验组运动员外周血细胞的彗星检测指标尾长、Olive尾矩、 尾分布矩并无显著差异（P>0.05）；对照组和实验组连续14天服用补剂后，运动前大蒜素补剂组运动员外周血细胞的彗星检测指标尾长、Olive尾矩、 尾分布矩均显示较对照组有降低趋势，但无统计上的显著差异（P>0.05）；运动后即刻，对照组运动员外周血细胞的彗星检测指标尾长、Olive尾矩、 尾分布矩均显示较运动前有非常显著的升高（P<0.001），而大蒜素补剂组运动员外周血细胞的彗星检测指标尾长、Olive尾矩、 尾分布矩较对照组有显著地降低（P<0.01），提示大蒜素显著地降低了力竭运动导致运动员外周血细胞的DNA损伤程度。

2.4服用大蒜素后运动员机体血清中SOD酶活性、GSH与MDA含量的变化

从表3可知，补剂前安静状态下对照组和实验组运动员机体血清中SOD酶活性、GSH与MDA含量并无显著差异（P>0.05）；补剂后安静状态下对照组和实验组运动员机体血清中SOD酶活性、GSH与MDA含量也无显著性差异（P>0.05）；而力竭运动后对照组运动员机体血清中SOD酶活性、GSH与MDA含量与补剂前安静状态下的水平相比，均呈显著性提高（P<0.05， P<0.05，P<0.001），与此同时，力竭运动后实验组运动员机体血清中SOD酶活性、GSH与MDA含量较对照组运动后的水平相比，均呈不同程度地显著性降低（P<0.05， P<0.05，P<0.001），而与补剂前安静状态下的对照组和实验组水平相比并无显著差异（P>0.05），提示大蒜素有效降低脂质过氧化产物水平。表2大蒜素对运动员外周血细胞DNA损伤指标的影响

组别N尾长Olive 尾矩尾分布矩C组补剂前835.12±10.1214.56±3.2678.94±24.78T组补剂前835.92±8.6214.61±4.9779.38±17.64C组补剂后834.88±10.0814.48±4.75 77.85±18.42T组补剂后834.16±7.24 14.38±3.78 75.17±21.45C组运动后862.90±12.61***21.15±4.61***95.00±27.58***T组运动后842.60±11.29▲▲15.81±3.82*▲▲83.16±19.71▲▲注：与C组补剂前相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001； 与C组运动后相比， ▲▲P<0.01， ▲▲▲ P<0.001。

表3大蒜素干预后运动员血清中SOD、GSH和MDA的变化

组别NSOD（U/ml）GSH（mg/L）MDA （nmol/ml）C组补剂前790.37±13.64103.75±14.214.34±0.92T组补剂前788.63±14.11105.38±16.464.56±1.03C组补剂后798.25±12.10107.13±18.064.29±0.93T组补剂后799.63±17.62100.75±14.27 4.16±1.07C组运动后122.63±15.09*127.13±19.56*7.74±1.11***T组运动后102.13±11.89▲106.38±24.64▲5.40±1.04▲▲▲注：与C组补剂前相比，*P<0.05， ***P<0.001； 与C组运动后相比， ▲P<0.05， ▲▲▲P<0.001。

3讨论

近年来研究发现大蒜素具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、清除自由基、预防心脑血管疾病等多种功效[1-3]。已有临床研究证实，大蒜素可有效降低糖尿病大鼠的MDA水平，减轻氧化应激损伤的程度[11]。剧烈运动可使体内活性氧产生，脂质过氧化增强如MDA水平升高，导致运动能力下降和引发运动疲劳，其产生机制之一是由于运动过程中呼吸频率的增加，致使空气污染物NO2和O3等随着呼吸摄入增多而增多，而这些自由基正是通过呼吸道增加了氧化损伤的机率[12]。然而机体细胞拥有一个复杂的网络工作机制来抵抗活性氧（ROS）自由基的产生进而来保护大分子物质免遭侵害，这些工作通常由抗氧化物质SOD、GSH、AA和VE等来完成，通过摄入抗氧化物质也是一个非常重要的渠道[13]。DNA是活性氧（ROS）自由基攻击的重要靶分子，自由基氧化还原反应可引起DNA分子的碱基修饰或链断裂等多种后果，导致一系列生理功能紊乱和组织病理学改变，甚至是癌变，且DNA的损伤程度与疾病的严重程度密切相关[14]。国外一些研究报道了大强度运动会导致DNA的损伤，其损伤程度与运动强度、时间和个体水平有关[15-16]。实验室前期研究发现运动性氧应激参与介导了组织细胞的DNA损伤，且DNA的损伤程度与氧化应激水平呈正相关[17-18]。因此本实验进一步采用SCGE检测技术发现，补充大蒜素运动员力竭运动后外周血细胞的DNA损伤水平显著低于对照组力竭运动后的水平。可见，大蒜素对力竭运动所致的DNA损伤具有明显的保护效应。Hassan Farhad[19]等研究发现，补充大蒜素能够明显降低人体运动后DNA氧化损伤的修饰物之一即8-羟基鸟苷（8-OHDG）的含量，这与本研究结果相类似。

SOD和GSH 是体内抗氧化系统中主要的抗氧化生物标志物，MDA是氧自由基对多价不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化反应的最终产物，它们的含量高低可反映机体组织细胞脂质过氧化反应的强度及体内自由基代谢的情况[20]。本实验结果发现，对照组力竭运动后血清MDA水平显著上升，SOD和GSH抗氧化酶活性也出现显著地代偿性升高，且DNA损伤水平较对照组运动前水平亦呈显著增加趋势，说明力竭运动使脂质过氧化产物MDA水平显著升高，导致DNA氧化损伤程度加深，同时机体组织以过量表达SOD和GSH来提高机体抗氧化系统能力，清除羟基，降低过氧化压力，减少剧烈运动负荷引起的大量毒性的活性氧[2]。然而，力竭运动后补充大蒜素组运动员机体血清中SOD酶活性、GSH与MDA含量较对照组运动后的水平相比，均呈不同程度地显著性降低，且DNA损伤水平较对照组运动后水平呈显著降低趋势，说明补充的大蒜素直接参与了清除运动过程中产生的自由基，并显著降低了机体的脂质过氧化程度，从而降低了人体外周血细胞的DNA损伤值。此实验结果与其他研究[9]发现大蒜素较其它抗氧化剂更能有效降低运动员机体氧化应激水平的结论相一致。而大蒜素的补充剂量效应还有待进一步研究。

4结论

力竭性跑台运动可诱导人体外周血细胞DNA损伤值增加及脂质过氧化产物MDA水平的升高，介导机体组织SOD和GSH抗氧化酶活性的过量表达，大蒜素能够提高机体抗氧化能力，稳定细胞膜结构，降低自由基水平，减轻和预防运动性氧应激所致的DNA损伤，对防治运动疲劳具有较好的营养保健功效。

参考文献：

[1]张天亮， 颜燕， 姚文环，等. 大蒜素亚慢性染毒对大鼠抗氧化系统的影响[J]. 毒理学杂志， 2011， 25（3）： 226-229.

[2]刘重斌， 王瑞， 董缪武， 等. 大蒜素对慢性铁中毒大鼠氧化应激与肝细胞自噬的抑制作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志， 2012， 26（4）： 515-521.

[3]Bautista DM，Movahed P，Hinman A，et al.Pungent products from garlic activate the sensory ion channel TRPA1 [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005， 102（ 34）：12248-12252.

[4]Phaneuf S， Leeuwenburgh C. Apoptosis and exercise [J]. Med Sci Sports Exerc， 2001， 3：393-396.

[5]Kyto V， Lapatto R， Lakkisto P，et.al.Glutathione depletion and cardiomyocyte apoptosis in viral myocarditis [J]. European Journal of Clinical Investigation， 2004， 34（3）：167-175.

[6] Selman C， McLaren JS， Collins AR，et al.Antioxidant enzyme activities， lipid peroxidation， and DNA oxidative damage： the effects of short-term voluntary wheel running [J].Arch Biochem Biophys， 2002， 401（2）： 255-261.

[7] Roy， Marc D. Approach for assessing total cellular DNA damage [J]. Biotechniques， 2007， 42 （4）： 425-429.

[8] Bruce RA， McDonough JR. Sress testing in screening for cardiovascular disease[J]. Bull N Y Acad Med， 1970， 45（12）： 1288-1305

[9] 赵广高，苏全生，李新建，等. 大蒜素与联合抗氧化剂对一次大强度离心运动后运动员血清T-AOC 等水平的影响[J]. 首都体育学院学报， 2012， 24（2）：189-192.

[10] Hartmann A， Agurll E， Beevers C，et al.Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay [J]. Mutagenesis， 2003， 18 （1）：45-51.

[11] 段玉敏， 王 宾. 大蒜素对2型糖尿病大鼠氧化应激反应的影响[J].现代中西医结合杂志，2010， 19（18）：2240-2241.

[12] Powers SK， Jackson MJ. Exercise-Induced Oxidative Stress： Cellular Mechanisms and Impact on Muscle Force Production[J]. Physiol Rev， 2008， 88（4）：1243-1276.

[13 ] R John Aitken ， Shaun D R. Antioxidant systems and oxidative stress in the testes [J]. Oxid Med Longev， 2008， 1（1）：15-24.

[14 ] Best， Benjamin P. Nuclear DNA damage as a direct cause of aging[J]. Rejuvenation Research， 2009， 12 （3）： 199–208.

[15] Tsai K， Hsu TG， Hsu KM，et al.Oxidative DNA damage in human peripheral leukocytes induced by massive aerobic exercise [J]. Free Radic. Biol. Med， 2001， 31：1465-1472.

[16] Demirbag R.， Yilmaz R， Güzel S，et al. Effects of treadmill exercise test on oxidative/ antioxidative parameters and DNA damage[J]. Anadolu Kardiyoloji Dergisi， 2006， 6（2）：135- 140.

[17] 刘晓莉， 苏美华， 乔德才. 运动疲劳诱导小鼠心肌细胞氧化应激与DNA损伤[J]. 中国运动医学杂志， 2008， 27（5）：621-623.

[18] 刘晓莉， 苏美华， 沈飞， 等. 马拉松运动对人体外周血细胞DNA损伤和氧化应激的影响[J]. 北京体育大学学报， 2009，32（7）：60-62.

[19] Hassan Farhadi， Marefat Siakuhian， Homayun Dolatkhah，et al.Effect of short-term garlic supplementation on DNA damage after exhaustive exercise in non-athlete men[J].European Journal of Experimental Biology， 2013， 3（1）：455-459.

[20] Etsuo Niki .Assessment of Antioxidant Capacity in vitro and in vivo[J].Free Radical Biology and Medicine， 2010， 49（4）：503-515.第30卷第6期2014年12月山东体育学院学报Journal of Shandong Institute of Physical Education and SportsVol.30 No.6December 2014