大鼠原发性脑干损伤后S100B和GFAP的表达变化

吴雨虹，王慧君，王欣

（1.南方医科大学法医学系，广东广州510515；2.广州市公安局刑警支队技术所法医检验科，广东广州510030）

脑损伤后神经胶质细胞，尤其是星形胶质细胞常出现反应性胶质增生，这是中枢神经损伤及退行性病变引起的神经组织发生改变的常见现象。S100B蛋白和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillory acidic protein，GFAP）均为神经胶质细胞的标记蛋白，故研究二者在损伤后不同时段的表达变化，有助于了解损伤后胶质细胞的修复情况及推断损伤时间。本实验采用机械性打击致脑干损伤动物模型，应用免疫组织化学法，结合计算机图像分析技术，检测大鼠脑干损伤后不同时段脑干组织中S100B、GFAP的表达情况，探讨其在原发性脑干损伤中可能的作用机理及损伤时间的变化规律。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

自制打击装置，Nikon-ECL IPSE 801光学显微镜（日本尼康公司），即用型通用SP免疫组织化学试剂盒、兔抗GFAP多克隆抗体、DAB试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司），大鼠抗S100B多克隆抗体（美国SANTA公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.2 动物模型建立及分组

SD雄性大鼠48只（购自南方医科大学实验动物中心），体质量180~220g。采用随机分组法，将实验动物取6只作为对照组，余42只进行建模。自制撞击装置，将内径为1.2 cm的光滑导引管固定在铁支架上，将一木板固定在铁支架的底座上，前端设置一垂直的小挡板，导引管与底座的夹角呈45°。采用100g/L水合氯醛按300mg/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠后，切开头皮，暴露颅骨，使大鼠俯卧于底座上，调整引导管对准枕骨粗隆，打击物从导引管的一端自由下滑打击大鼠枕部，每只大鼠只打击1次，造成脑干损伤。

脑干损伤模型大鼠在建模后30min内死亡6只，记为伤后30min组，伤后存活者随机分为6组，每组6只，分别于伤后2、6、12、24、48、72h断头处死；对照组大鼠直接断头处死。

1.3 取材及染色

大鼠断头处死后，立即取脑干组织，放置于4%多聚甲醛固定24h。将脑干沿正中线切开，以切面为包埋面常规脱水，石蜡包埋制成蜡块，组织经连续切片，厚度为3μm，分别进行常规HE染色及Gless嗜银染色，并行SP法免疫组织化学染色。

1.4 图像分析及统计学处理

应用HMIAS-2000W高清晰度彩色医学图文分析管理系统（武汉千屏影像技术有限责任公司），在400倍显微镜下，随机选取5个视野，对免疫组化阳性细胞进行检测，测定阳性细胞的平均灰度值。数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较用LSD法。检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 实验动物临床观察

实验大鼠受打击后，均立即出现昏迷、角膜反射消失、抽搐、呼吸急促、心搏加快等体征。伤后30min组的大鼠约在损伤后30s出现不规则的呼吸和心搏，数分钟后出现心律不齐且搏动减弱，呼吸变慢变深，20~30 min心搏停止。伤后存活的大鼠10~15 min后呼吸和心搏基本恢复正常，约1 h后逐步苏醒，生命体征平稳，未出现再次昏迷。

2.2 肉眼及HE染色观察

所有脑干损伤大鼠均可见蛛网膜下腔明显出血，脑干组织水肿，脑干内见散在的点片状或椭圆形小片状出血，伤后30min组出血部位较为广泛，伤后存活者，出血部位相对较少。

2.3 Gless嗜银染色观察

对照组大鼠脑干组织轴索排列规整，走行一致，轴索间隙均一。伤后30min组大鼠弥漫性轴索肿胀、断裂、扭曲呈蚯蚓状，轴索末端膨大、间隙增宽。伤后2、6 h在脑干见到上述轴索损伤变化更加明显，以轴索断裂、肿胀及扭曲为主。伤后12 h可观察到轴索断裂后轴浆流出到脑组织局部所形成的轴索收缩球（图1），伤后24h轴索收缩球数量增多，体积增大，伤后48、72h轴索肿胀情况有所好转。

图1 脑干损伤后12h轴索收缩球形成Gless×400

2.4 SP免疫组织化学染色观察

2.4.1 S100B的表达

对照组可见S100B阳性细胞染色均匀分布在星形胶质细胞胞体及突起中（图2A）。伤后30min，星形胶质细胞结构破坏，突起消失，S100B从星形胶质细胞中释放，表达增加（图2B，表1，P＜0.01）。之后随着时间的延长脑干组织中S100B阳性表达逐步升高，并于24h达到高峰（图2C，表1，P＜0.01）。伤后48h，S100B阳性表达有所下降，但仍高于对照组（P＜0.01），此时可见少数细胞出现单一细长突起。72h基本降至正常水平，细胞体积进一步增大并可见胞核（图2D，表1，P＜0.01）。

2.4.2 GFAP的表达

对照组GFAP分布在星形胶质细胞的胞质及突起中，胞体较小，突起纤细。伤后30min，GFAP表达增加（P＜0.01，表1），有的细胞形态变得不规则（图3A）；伤后2h，GFAP表达进一步增强（P＜0.01，表1），突起染色加深（图3B），之后随时间的延长逐步上升，48h达到高峰（P＜0.01，表1），胞质染色加深，突起增多，形态不规则（图3C）；72 h表达下降但仍高于对照组（图3D，表1，P＜0.01）。

图2 脑干组织中S100B阳性表达SP×400

图3 脑干组织中GFAP阳性表达SP×400

表1 大鼠脑干损伤后S100B、GFAP阳性细胞平均灰度值（n=6，±s）

表1 大鼠脑干损伤后S100B、GFAP阳性细胞平均灰度值（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与相邻上组比较，P＜0.01

组别对照伤后30min伤后2h伤后6h伤后12h伤后24h伤后48h伤后72h S100B 80.774±0.893 86.158±0.7931）2）89.858±0.9371）2）92.198±0.2691）2）94.006±0.6631）2）98.518±0.7761）2）87.954±1.1871）2）81.114±1.0092）GFAP 31.508±0.465 35.938±0.4011）2）37.838±0.5441）2）39.926±0.6841）2）42.530±0.6531）2）44.826±0.4641）2）47.888±0.5471）2）45.922±0.2681）2）

3 讨论

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多、最重要的支持细胞，在中枢神经系统的多种正常生理活动以及神经组织的修复与再生、神经免疫、多种神经疾病的病理机制中都起着十分重要的作用。S100B是一类分子量较小的EF手型钙离子结合蛋白，具有广泛的生物学活性，主要由中枢神经系统中星形胶质细胞、少突胶质细胞及周围神经系统的雪旺细胞分泌，是星形胶质细胞激活的标志之一，可使神经元及胶质细胞内钙离子浓度增加[1]，而Kligman等[2]报道了在脑皮质神经元培养中，脑S100B蛋白的二硫化物能刺激神经生长，推测S100B蛋白可能通过神经胶质细胞分泌后通过类似旁分泌的作用[3]，刺激神经生长。在损伤反应中S100B表达明显增加，且与损伤程度和时间有一定关系[4-6]。GFAP是一种中间丝细胞骨架蛋白，在中枢神经系统中特异性地由星形胶质细胞表达，被认为是星形胶质细胞及由其发生的肿瘤的特异性标志物[7]。星形胶质细胞反应的标志是细胞数增加、细胞体肥大、分支增多，GFAP表达增强。因此星形胶质细胞的增殖程度和脑干损伤后脑组织的病变程度可用GFAP的表达值来评价。

本研究采用机械性撞击法[8]，在保证同等打击力度和作用时间的前提下，使外来机械力直接作用于颅骨，并能准确打击大鼠的枕骨粗隆，使脑干受到损伤。HE染色可见脑干组织内有点片状或椭圆形小片状出血，并有蛛网膜下腔出血；Gless嗜银染色发现大鼠弥漫性分布的轴索肿胀、断裂、扭曲、末端膨大，轴索间隙增宽并收缩球的形成，表明所建立的原发性脑干损伤动物模型科学、可信。

本研究发现，在脑干损伤后30 min内，S100B与GFAP表达即开始增加，此时的增加可推断为星形胶质细胞的反应性肥大而非增生，同时由于星形胶质细胞结构的受损，S100B与GFAP从细胞中漏出导致二者水平的上升。而反应性星形胶质细胞增生和活化产生大量的S100B本身也促进星形胶质细胞的肥大和增殖，又提高了GFAP的水平，从而形成正反馈放大效应。本实验证明随着伤后时间的延续，S100B与GFAP水平不断升高，24 h和48 h分别为S100B与GFAP水平的最高峰，之后的表达有所下降，到72 h二者水平下降，且S100B与对照组差异无统计学意义。可推测随着时间的进展，损伤反应不断增强，24~48h是胶质细胞损伤反应的顶峰，之后损伤反应减弱、胶质细胞自我修复、再生不断增强，S100B与GFAP表达量减少，直至修复完成。

有研究[9]证实，脑外伤后大量星形胶质细胞瘢痕的形成是新生的星形胶质细胞而非已经存在活化的细胞或迁移细胞所形成。本研究发现脑损伤后S100B、GFAP阳性表达的变化特征，说明星形胶质细胞在不断被激活新生，这不仅有利于胶质瘢痕的形成，也有利于神经元的修复和功能的恢复。同时，由实验结果可知，在脑干损伤后S100B与GFAP的表达随时间呈现一定的变化规律，如果将两项指标联合，综合分析，可以为损伤时间的推断提供一定的帮助。

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