miRNAs在肿瘤基因治疗中的研究进展*

miRNAs在肿瘤基因治疗中的研究进展*

杨光华 殷保兵**

（上海复旦大学附属华山医院普外科 上海 200040）

摘 要成熟miRNAs是一类长度为20~23个核苷酸的非编码单链小RNAs。近年来，陆续发现miRNAs与肿瘤的发生、分化、转移及复发等密切相关。miRNAs作为一种调节因子，通过与靶mRNA的完全或不完全互补结合抑制靶mRNA表达，进而在转录后水平调节肿瘤相关基因的表达。随着对miRNAs的基础生物学和生物信息学的进一步研究，可以预见未来miRNAs作为肿瘤基因治疗的新靶点有着广泛的应用前景。

关键词肿瘤 miRNA 基因治疗

*基金项目：上海市科委纳米专项基金（12nm0501502）

The advance of miRNAs in cancer gene therapy

YANG Guanghua, YIN Baobing

(Department of General Surgery, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

ABSTRACTMature miRNAs which consist of 20–23-nucleotide single-stranded RNAs are closely related to biological processes of cancer, such as its occurrence, differentiation, metastasis and recurrence. miRNAs, as key regulators, can inhibit mRNA expression by recognizing specific mRNA targets, and further mediate post-transcriptional inhibition of cancer related genes. With the further understanding of fundamental biology and bioinformatics, miRNAs will serve as a novel cancer therapeutic target with a broad application prospect.

KEY WORDSneoplasms; microRNA; gene therapy

成熟的miRNAs是一类长20~23个核苷酸的非编码单链小RNAs，其初级转录体在细胞核内由加工miRNAs的微处理器复合体（Drosha-DGCR8 protein complexes）催化生成70个核苷酸的前体miRNAs。前体miRNAs由核输出蛋白-5转运至细胞质中，由核糖核酸Ⅲ酶（Dicer）催化后生成miRNA：miRNA*二聚体。在RNA解旋酶作用下，其中miRNA与Argonaute 蛋白(AGO)结合后，作为核蛋白复合物的核心与靶mRNA的3'端的非编码区完全互补或不完全互补结合，直接切割或抑制其翻译表达，在转录后水平负调控基因表达，而 miRNA则释放至细胞质中并被降解。这些机制表明miRNAs可以通过对靶基因的调控进而干预多种信号转导通路，在细胞生长、增殖、发育和凋亡过程中扮演重要角色。本文就miRNAs在肿瘤疾病演进过程中异常的生源途径及其扮演的不同角色，以及其在肿瘤基因治疗中的应用进展进行总结。

1 miRNAs生源途径的异常变化

在肿瘤的发生、发展进程中，miRNAs的生源途径会出现各种异常变化。miRNAs与肿瘤的生物进程之间的关系是复杂的调节反馈环。现将几种重要的异常变化总结如下：①某些miRNA上游基因位于染色体不稳定区域或靠近染色体断点区域，这易导致miRNAs出现异常扩增、易位或缺失，进而表达异常[1]。②在肿瘤细胞中会出现编码Dicer1基因的半合缺失，从而导致DICER1表达量下降。实验证明，通过减少DICER1表达导致的相关miRNA表达异常可加速成视网膜细胞瘤小鼠模型的肿瘤形成，提示DICER1可作为单倍不足的肿瘤抑制因子[2]。另外，抑制Drosha 及其辅助因子DGCR8的表达也可抑制成熟miRNAs生成。③类胚胎致死性异常视觉基因编码蛋白、睾丸生殖细胞瘤易感基因编码蛋白等的RNA结合蛋白(RBPs)与miRNAs的协同或竞争效应均可导致miRNAs与靶mRNA结合位点异常，

进而使相关癌基因或抑癌基因表达量异常。另外，可变聚腺苷酸化也可缩短mRNA 3'UTR，导致结合位点异常[3]。上述各种异常变化导致miRNAs表达异常和（或）miRNA-mRNA目标识别失调，进一步造成下游与肿瘤分化、凋亡、增殖、干细胞维护、复发和转移等密切相关蛋白的表达异常。

2 抑癌性miRNAs和致癌性miRNAs

根据miRNAs在肿瘤生物进程中所扮演的不同角色可以分为抑癌性miRNAs和癌基因性miRNAs。与编码基因相比，在肿瘤基因治疗中将miRNAs作为治疗靶点能更高效的发挥抑瘤作用。通过载体转载外源性抑癌性miRNAs或反义寡聚核苷酸(AMOs)进入肿瘤细胞，可以调节肿瘤生物进程中相关基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。

2.1 抑癌性miRNAs

通过稳定转染或瞬间转染相关外源抑癌性miRNAs，可使肿瘤细胞中抑癌性miRNAs高表达，进而通过抑癌基因和（或）一些参与肿瘤生物进程的相关基因，达到治疗肿瘤的目的。

2.1.1 Let-7

Let-7家族的上游基因定位于染色体的9q22.3、21p11.1和3p21.1-p21.2区域，在许多恶性肿瘤中，let-7家族的表达量都显著降低。let-7家族成员的低表达通常由miRNA上游基因在染色体对应区域的缺失或由Dicer 1辅因子TARBP2磷酸化导致。Torrisani等[4]报道let-7作为抑癌基因可表达于正常胰腺细胞，但在胰管腺癌（PDAC）组织中出现下调。进一步研究表明，将外源性let-7转染胰腺癌细胞可抑制K-RAS表达和癌细胞增殖。因此，let-7被认为是PDAC的抑癌基因。但是，研究也表明K-RAS翻译区的靶向多态性会干扰let-7的功能，这种机制的存在可能会导致let-7治疗效果的不确定性。Paranjape等[5]也在乳腺癌中阐述了这种机制。

2.1.2 miR-26

Ji等[6]的研究表明，在肝癌细胞中呈高表达的miR-26可显著下调cyclin E2蛋白的表达，并抑制癌细胞增殖。此外，有研究也表明miR-26低表达的肝癌患者的总体生存期短于高表达者，而后者对干扰素的治疗也更为敏感。最近的研究表明，miR-26a在膀胱癌细胞株T24中呈高表达，其可通过靶向HMGA1抑制癌细胞增殖和侵袭。这些结果表明miR-26a可作为肿瘤基因治疗的重要靶点[7]。

2.1.3 其他抑癌性miRNAs

Hu等[8]的研究表明miR-141可能通过调节SIP1蛋白而抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移，这使其可能成为治疗结直肠癌的新靶点。Ye等[9]的研究表明，在大多数结直肠癌组织中miR-27b表达量降低，而通过转染外源性miR-27b可调节VEGFC的表达而进一步抑制结直肠癌细胞的增殖。

2.2 癌基因性miRNAs

在肿瘤中过度表达的内源性miRNAs被认为是癌基因性miRNAs（又称oncomirs），它常通过抑制那些控制癌细胞分化或凋亡的相关肿瘤抑癌基因发挥作用。癌基因性miRNAs可以被人工合成的抗miRNAs反义寡聚核苷酸（AMOs）拮抗。此外，研究者发现有同时抑制多种miRNAs基因的方法，Obad等[10]发现将源靶向的微小锁核酸(LNAs)转染入细胞，会同时导致同系家族miRNAs被抑制。其他一些研究发现，在胃癌细胞系（SGC7901）中，转染针对miR-221/21和106a的多靶点反义寡聚核苷酸(MTg-AMOs)，可以特异性的抑制多种miRNAs的表达，并且有效地抑制胃癌细胞的增殖和转移。

2.2.1 miR-21

miR-21在多种癌组织中都有高表达现象[11-13]。研究发现在肝细胞癌组织中，miR-21通过靶向PDCD4、PTEN、RECK调节肿瘤细胞的程序性凋亡、癌细胞增殖、转移和侵袭能力。对miR-21的抑制或许能成为治疗肝细胞癌和弥漫性B细胞淋巴瘤(DLBCL)的新疗法[14-15]。另外，越来越多的证据揭示了上皮间质转化（EMT）和肿瘤干细胞的生物学行为是肿瘤的侵袭性和转移的重要因素，两者可通过miR-21相互联系。在对乳腺癌的研究发现，通过拮抗miR-21可上调PTEN表达和抑制AKT和ERK1/2通路，进而逆转EMT和肿瘤干细胞的表型[16]。

2.2.2 miR-10b

目前的研究表明miRNA-10b的多效性是由于其对多种抑癌基因的抑制，如TP53、FOXO3、CYLD、PAX6、

HOXD10和NOTCH1。在人胶质瘤原位小鼠动物模型中，抑制miRNA-10b可减弱胶质瘤细胞的间叶组织细胞生长、血管再生和侵袭性，并认为其或许是胶质瘤发生的多效调节因子[17]。另外，Jin等[18]也发现miR-10b在转移性乳腺癌细胞中高表达，其通过抑制HOXD10靶点促进乳腺癌细胞的转移和侵袭。借助PLL-RNA纳米粒子，将反义miRNA-10b转染入乳腺癌细胞质中，可抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭。

2.2.3 miR-23a

Lian等[19]的研究结果表明，在79个胶质瘤组织样本中，miR-23a的表达水平明显高于癌旁组织。在胶质瘤细胞中，转染反义miR-23a，可激活能抑制胶质瘤细胞生长和促进细胞凋亡的细胞凋亡蛋白酶激活因子-1(APAF1)，从而抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这个结果提示miR-23a可能成为新的神经胶质瘤治疗靶点。

3 miRNAs与化疗

肿瘤的异质性使传统化疗效果不一。肿瘤可能对依靠大量信号级联反应的单通路靶向治疗产生耐药，这种固有或获得性耐药是导致化疗药物不能消除全部肿瘤组织从而引起肿瘤复发的最常见原因。miRNAs在改变肿瘤对化疗药物反应中有很多潜在作用，包括调节DNA甲基转移酶1(DNMT1)和多药耐药蛋白，改变药物作用靶点和药物浓度，影响化疗诱导的细胞凋亡，调节血管形成和肿瘤干细胞[20]。

3.1 miRNAs与DNMT1/MDR

研究表明，miR-21的过表达和凋亡相关蛋白4 （PDCD4）的下调可使细胞凋亡蛋白抑制因子（LAPs）和多药耐药蛋白1表达上调，进一步导致乳腺癌中肿瘤细胞抗凋亡和耐药性的产生。值得注意的是，转染了反义miR-21的MCF-7细胞系（乳腺癌细胞系），对化疗药物更敏感及更易凋亡，表明这种策略可以在一定程度上克服乳腺肿瘤细胞的化疗耐药性[21]。此外，在耐药的恶性胶质细胞瘤细胞中也发现了过表达的miR-21。通过特异性反义寡核苷酸抑制miR-21的过表达，可增强半合成鬼臼毒素衍生物（VM-26）对U373 MG恶性胶质细胞瘤细胞的细胞毒性作用[22]。最新的研究还表明，miR-152 或miR-185可增加顺铂耐药卵巢细胞系SKOV3/ DDP和A2780/DDP细胞的药物敏感性[23]。

3.2 miRNAs和Bcl-2家族

细胞对凋亡信号的反应可能会影响疗效，许多miRNAs通过抑癌基因Bcl-2参与了细胞凋亡过程。过表达miR-204可通过靶向调节Bcl-2家族成员抑制胃癌细胞的集落形成能力和迁移能力，并进一步增加胃癌细胞对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的敏感性。这些结果表明，通过miR-204的过表达抑制Bcl-2家族成员的活性，可能成为预防和治疗胃癌的新策略[24]。Zhu等[25]的研究表明，miR-497在多药耐药的人胃癌细胞系SGC7901/长春新碱（VCR）和多药耐药性人肺癌细胞株A549/顺铂（CDDP）中表达下调，同时证明下调的miR-497与上调的Bcl-2蛋白具有相关性，进一步证明了过表达的miR-497可抑制BCL-2家族成员，进而增加SGC7901/VCR和A549/ CDDP细胞对VCR-和CDDP诱导的细胞凋亡敏感性。

3.3 miRNAs和VEGF

很多药物可靶向肿瘤血管阻断肿瘤的丰富血供，如贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼等。然而，由于肿瘤对VEGF抑制剂产生的耐药性只能使一部分患者从中获益。Hua等[26]分析预测，至少有96种miRNA直接参与了VEGF的调节。此外，除了直接调节VEGF表达外，许多miRNAs可间接介导VEGF信号通路，如miR-126[27]。随着miRNAs与肿瘤血管生成关系的进一步研究，可能会在抗肿瘤血管生成方面提供一个优化选择。

3.4 miRNAs和肿瘤干细胞

肿瘤干细胞可能与肿瘤发生、耐药性、增殖、复发和转移相关。近年来，let-7、miR-128和miR-34a与肿瘤干细胞之间的关系已得到证实，在乳腺癌、前列腺癌和恶性胶质细胞瘤中，miRNAs是调控肿瘤干细胞的重要因子[28]。最近的一项研究表明，miR-34a可通过抑制CD44，进而抑制肿瘤干细胞在前列腺癌中的形成[29]。

3.5 miRNAs和细胞间隙连接（GJIC）

另外，化疗耐药性与药物在细胞间传输过程中浓度降低有关。GJIC是细胞间的重要连接方式，药物可通过GJIC从靶细胞转移到相邻细胞，使更多的细胞对化学药物产生效应。但是由于间隙连接成分，如跨膜蛋白的连接蛋白类（Cx），常在癌细胞中缺失，使肿瘤和转化细胞普遍存在GJIC缺陷，恢复GJIC能提高药物敏感性[30]。目前已证实miR-1和miR-206可以靶向Cx，导

致GJIC损害[31-32]。

4 miRNAs与放疗

放疗利用电离辐射造成DNA双链断裂引起细胞失活和细胞死亡，因为各类肿瘤及其周围正常组织对于辐射的敏感性不同，寻找影响肿瘤辐射敏感性的因素对于放疗非常重要。而调控基因表达的miRNAs可以影响肿瘤细胞对辐射的敏感性。miRNAs对放疗相关的信号转导通路的调控可分为三个方面：①表皮生长因子受体（EGFR）和胰岛素样生长因子受体作为上游受体；②MAPK/ERK通路、PI3K/AKT通路、PI3K/AKT通路、TGF-β通路作为中游转导通路；③DNA损伤应答基因、细胞周期和凋亡相关基因作为下游效应因子，表明miRNAs在调节肿瘤细胞辐射反应和辐射敏感性中发挥了重要作用[33]。

4.1 miRNAs与EGFR

研究表明EGFR过表达或突变与肿瘤细胞对放疗的抵抗力密切相关，它通过激活细胞增殖通路，如PI3K/ AKT、MAPK/ERK通路发挥作用[34-35]。除此机制之外，EGFR还参与放射诱导的核易位，并与DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK)相互作用。在人类癌细胞中，miR-7的过表达不仅使EGFR和EGFR相关信号通路（如EGFRPI3K-AKT通路）表达失活，同时也增强辐射诱导的γH2AX焦点形成，减少DNA-PK[36]。研究表明miR-133 以EGFR为靶标抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，特别是在激素非依赖型前列腺癌细胞系中[37]。这些结果证明，靶向EGFR的DNA损伤修复功能或者阻碍其下游的信号通路可作为增加放疗敏感性的可选择的方案。

4.2 miRNAs与中游转导通路

许多miRNAs与放射相关的信号转导通路的中游转导因子相关，如miR-7 以PI3K/AKT通路为靶点抑制肿瘤发生，逆转肿瘤细胞的转移过程[36]，miR-17-5p 以MAPK/ERK通路为靶点调节肿瘤的增殖和迁移[38]，miR-31以核因子（NF）-κB通路为靶点激活NF-κB通路，影响肿瘤细胞的增殖和凋亡[39]，miR-520c/miR-373以转化生长因子（TGF）-β通路为靶点影响肿瘤的转移、炎症反应和进展[40]。

4.3 miRNAs与DNA损伤应答基因

有许多miRNAs以DNA损伤应答基因的主要组分如ATM、ATR、DNA-PK、Chk1和Chk2为靶点，这些组分也参与了癌细胞的放射敏感性和（或）化疗敏感性的调节[41]。有研究表明肾细胞癌细胞在进行电离辐射处理后，其hsa-miR-185的表达下调。实验进一步表明上调miR-185可抑制ATR通路，使肾细胞癌细胞在体内外对X射线敏感，增强辐射诱导的凋亡，抑制增殖。这些发现表明miRNAs无论作为直接的癌症治疗方法还是作为增强肿瘤细胞对放疗敏感的工具都具有潜在的应用价值[42]。

4.4 miRNAs与细胞周期/凋亡相关基因

在放射相关的信号转导通路中，多种细胞周期和凋亡相关基因的表达都在很大程度上受相关miRNAs活性的影响。研究显示在口腔鳞状细胞癌中miR-125b表达下调，过表达miR-125b可以降低口腔鳞状细胞癌的增殖速率，并通过靶向ICAM2的mRNA提高口腔鳞状细胞癌对X射线辐射的敏感性[43]。在CL1-0肺腺癌细胞中，miR-449a的过表达可有效增强放射诱导的DNA损害和凋亡，改变细胞周期分布，并最终导致CL1-0对放射的敏感性增加[44]。此外，最近的研究表明miR-375在胃癌细胞系（AGS）中的过表达可减少P53蛋白的表达及对电离辐射和依托泊苷不敏感的细胞数[45]。

5 miRNAs在肿瘤基因治疗中的载体

在肿瘤基因治疗中，如何转载包括miRNAs的外源基因进入靶细胞，并使它们高效表达，从而达到治疗目的非常重要。由于miRNAs可能被体循环和（或）细胞质的核酸酶降解，所以使用基因载体保护miRNAs的结构和功能完整性非常必要。理想的载体应该能保持基因不被体内核酸酶降解，能有效传递基因特异性，保持体内外稳定性，并可以大规模生产。此外，载体及其降解产物应该无毒性、无免疫原性。

基因载体可分为病毒载体（腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体和逆转录病毒）和非病毒载体（脂质体、多糖、多肽、合成聚合物）。病毒载体中的逆转录病毒载体、腺病毒载体等，均或多或少地存在不足之处，影响了基因治疗的有效性和安全性。如逆转录病毒载体存在无法高效转导非分裂期细胞，腺病毒载体在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。而慢病毒载体相对于其他类型的病毒载体，不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，具有一定的应用前景。与病毒载体

相比，非病毒载体因为有更低的免疫原性、毒性和生产成本，以及更强大的转运靶向能力等优势，应用更为广泛。近年来，在非病毒载体中，研究者更青睐脂质体，根据性能和电荷特性，脂质体可分为普通脂质体、热敏感性脂质体、光敏感性脂质体、磁性脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体、中性脂质体、阴离子脂质体和阳离子脂质体等。其中阳离子脂质体是一种带正电荷的脂囊泡，可以用作负电荷载质的转运载体，尤其适合转移蛋白质、多肽、寡核苷酸、RNA和DNA，其主要优势是可以直接与基因联合而无需事先封装基因[46]。免疫脂质体是通过抗体或抗体片段与脂质体表面结合制成，能在分子水平识别肿瘤靶细胞，可能比游离药物和非靶向性脂质体更能有选择性地杀死肿瘤目标，其在荷瘤动物体内的靶向性分布可使其在肿瘤中达到更高的药物浓度。磁性脂质体由封装磁性纳米粒子的脂质体制成，拥有很好的携药性能、磁性靶向能力和生物相容性[47]。

6 总结

随着miRNAs生源论和生理功能等相关机制的进一步明确，使miRNAs治疗相关疾病的研究有了长足的进步。目前，应用miR-122相关机制治疗丙型肝炎的研究已走在这方面的前列[48]。但是，将miRNAs相关理论知识向临床应用转化的工作才刚刚起步，还有许多问题需要解决。首先，由于缺乏大量临床标本支持，miRNAs在肿瘤基因治疗和诊断中的敏感性和特异性有待进一步验证。其次，应用miRNAs和化疗、放疗等现有的临床治疗手段的联合治疗策略尚停留在细胞和动物实验阶段，有待进一步发展。另外，安全有效的miRNAs载体还需要大量研究进一步评估。在不久的将来，随着转化医学的进一步发展，miRNAs作为肿瘤基因治疗的靶点将有广阔的应用前景。

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收稿日期：（2015-02-26）

通讯作者**简介:殷保兵，男，复旦大学附属华山医院外科副教授，硕士生导师，医学博士。擅长肝、胆、胰良、恶性肿瘤、胆道结石以及外科各种疑难杂症的诊治，主攻腹腔镜肝胆微创手术。E-mail:yinbaobing@126.com