脑尔康及其拆方组对AD模型小鼠脑内SYN、RAGE水平表达的影响＊

侯吉星 陈良梅 马新欣 李 玺△ 张露莹 西安市精神卫生中心（西安710061）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年期常见的一种中枢神经系统退行性病变，前期的研究证实，脑尔康对AD模型小鼠学习记忆障碍有明显的保护和改善作用，并初步探讨了该方改善认知的作用机理［1－4］。本实验通过构建AD模型小鼠，观察复方中药脑尔康及其拆方对慢性铝中毒AD模型小鼠学习记忆障碍的改善作用及对小鼠皮层、海马中突触素（Synaptophysin，SYN），高级糖基化终产物受体（Receptor for advanced gyration end products，RAGE）的影响，旨在探讨中药抗痴呆的作用机制，筛选出药味精简，疗效相当的组方，为进一步新药开发精练处方提供实验依据。

1 材 料 1.1 动 物 健康雄性昆明种小鼠70只，体质量30±2.8g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（陕）12－004号。

1.2 药物与试剂 中药脑尔康胶囊为院内制剂（陕卫药制剂注字920138），全方由人参、黄芪、川芎、丹参、益智仁、生地、菖蒲、冰片等组成。由西安交通大学医学院第二附属医院药房提供。结晶三氯化铝（分析纯，AlCl3·6H2O，相对分子质量241.43，天津市津北精细化工有限公司产品，批号111123）；抗SYN抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品，批号120815）；SABC免疫组化试剂盒（北京博奥森生物工程有限公司产品，批号120713）；抗RAGE抗体（北京博奥森生物工程有限公司产品，批号120602）。

1.3 主要仪器 跳台仪（西安交通大学医学院动物实验中心提供），台式离心机（上海夏普电器有限公司产品，型号：WP850A），石蜡切片机（日本PIKA SEIA公司，型号：RM－2245），低温冰箱（日本SANYO公司，医用冰箱500型），图像信号采集与分析系统（德国Leica公司 型号：Qwin550CW）。

2 方 法 2.1 药品、工作液制备 脑尔康浓缩液全方组：人参、川芎、丹参、益智仁、菖蒲各23g，冰片2.3g，熟地、首乌各35g，黄芪70g。按传统方法水煎，浓缩至257mL，使成每毫升含生药1g·mL－1，各拆方组生药量同原方，煎法相同。拆方1号组：人参、川芎各23g，熟地35g，冰片2.3g；拆方2号组：黄芪70g，首乌35g，丹参、菖蒲各23g；拆方3号组：人参、丹参各23g，首乌35g，冰片2.3g；拆方4号组：人参、丹参、益智仁各23g，冰片2.3g。水煎后均浓缩至257mL，使各拆方组合中生药浓度与全方中各相应生药浓度相同，115℃ 高压灭菌20min，备用；结晶三氯化铝固体粉末溶于双蒸水，配制浓度为10g·L－1，0.25μm双层超滤膜过滤，待用。

2.2 分组及模型的建立 采用随机数字法将实验小鼠随机分为7组，每组10只，按文献［5］，除空白组外，各组小鼠以AlCl3溶液100mg·kg－1，灌胃，隔日1次，共40d，造成慢性铝中毒AD模型；空白对照组用生理盐水0.2mL灌胃，隔日1次，共40d。

2.3 学习记忆成绩测试 最后一次腹腔AlCl3灌胃30 min后，将小鼠放置于跳台仪中，适应跳台环境3min，然后将小鼠轻放于平台上，当小鼠从跳台上跳下，接触跳台铜栅时，立即给予25V电压刺激，记录小鼠逃避至平台上的时间（潜伏期），并记录3min内的触电次数（错误次数），以此作为学习成绩。24h后进行测试，将小鼠置于平台上，记录其第一次跳下受电击的时间（潜伏期）及3min内受电击的次数（错误次数），以此作为记忆成绩。测试时若小鼠停留在平台上超过了3 min，其潜伏期以180s计。

2.4 给药后学习记忆成绩测试 于学习记忆成绩测试后第二天开始给药。依据剂量估换计算公式，全方组及各拆方组每天分别给予相应药物灌胃（14.3g·kg－1·d－1）；空白组和模型组每天给生理盐水灌胃（0.5mL·d－1），共30d。最后一次给药30min后，进行学习成绩测试，24h后再次测试记忆成绩。

2.5 SYN，RAGE测定 测试结束后处死小鼠，取右侧脑组织，4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，石蜡切片机切片，切片厚度4μm，每张切片含皮层、海马、齿状回，每只小鼠取5张切片，4张进行免疫组化染色，一张HE染色。免疫组化染色法检测各组小鼠皮层和海马SYN、RAGE表达水平。

2.6 图像分析 每组选取对应断面的切片，采用Image－Pro Plus3.0软件进行图像采集与分析，检测阳性反应物质的平均灰度值。

2.7 统计学方法 使用SPSS13.0进行统计学分析，各组数据用±s表示，各组数据的均衡性检验采用t检验。各组间差异用单因素方差分析，如满足方差齐性要求采用LSD法（Least－significant difference，最小显著差异法）进行两两比较，如不满足，则采用Dunnett’T3法。P＜0.05有统计学意义。

3 结 果 3.1 铝中毒对AD模型小鼠学习记忆的影响

与空白组比较，模型组小鼠记忆潜伏期明显缩短（P＜0.01），学习潜伏期明显延长（P＜0.01）；学习与记忆的错误次数明显增多（P＜0.01），表明用铝中毒所造成的AD小鼠模型学习记忆功能明显受损。除空白组外，其余各组间比较，学习记忆潜伏期及学习记忆错误次数均无明显差异（P＞0.05）。

3.2 脑尔康及其拆方组对AD模型小鼠脑内RAGE表达的影响 见表1。各用药组RAGE表达有不同程度的下降（P＜0.01或P＜0.05），以全方组及拆方1号组效果最为明显，且二者拮抗RAGE表达的效果无明显差异，并优于拆方2、3、4号组。

表1 脑尔康及其拆方组对AD模型小鼠脑内RAGE表达的影响（灰度值）

3.3 脑尔康及其拆方组对AD模型小鼠脑内SYN表达的 影响 见表2。

表2 脑尔康及各拆方对AD模型小鼠脑内SYN表达的影响（灰度值）

4 讨 论 本课题选用的脑尔康具有益智健脑，活血化瘀，补肾生髓之功效。方中人参、黄芪补中益气安神为君药；益智仁、首乌，熟地，健脾补肾生髓共为臣药；丹参、川芎活血化瘀共为佐药；菖蒲、冰片，开窍醒神共为使药。组方原则符合中医以髓海不足和痰浊内阻为AD病因病机的认识。本实验中拆方研究采用君臣佐使化裁法［6］，弥补了以往单纯利用数学模式进行分析的拆方方法，更好的反映出各药之间的协同拮抗等配伍关系。

老年斑主要成分β淀粉样蛋白（β－amyloid，Aβ）诱发的级联反应是AD的主要病理机制［7］。RAGE属于细胞表面免疫球蛋白超家族成员，在神经元、小胶质细胞及血管内皮细胞的表面均有表达。RAGE不但是Aβ跨血脑屏障内向转运的主要受体，还可以和可溶性Aβ单体结合，造成神经元损伤及突触可塑性降低，在AD的病理中还发挥主要作用［8－9］。RAGE在中枢神经系统表达的增加除造成血管系统自身炎症外，还促进Aβ跨血脑屏障内流，造成脑组织Aβ沉积及炎症反应的进一步加剧。作者的研究发现，各用药组可明显降低RAGE在海马和皮质的表达，其中全方组和拆方1号组作用最为显著。这提示脑尔康防治AD的机制之一可能是通过降低RAGE的表达来实现的，推测脑尔康改善AD模型小鼠抗痴呆可能与通过降低RAGE的表达从而拮抗Aβ的神经毒性作用有关。

研究发现AD患者脑内一个重要的病理改变是皮质和海马内突触联系的丢失。中枢神经系统许多功能通路因突触的丢失而中断了联系，引起多方面的功能障碍，其中最明显的是认知和记忆障碍。突触素的表达可以作为突触前终末的特异性标志物，用来检测突触的密度和分布。作者的研究发现模型组小鼠皮质和海马内突触素免疫反应产物较空白组及各用药组明显降低，小鼠的学习记忆能力显著下降，说明突触素变化对学习记忆能力具有重要的影响。本研究认为突触素的减少主要是由于铝选择性的蓄积在大脑受累的神经元，使神经元的代谢及蛋白质的合成能力受损，同时轴浆运输减慢，使得轴突终末突触素合成显著减少。本实验中，各用药组海马区和皮质突触素免疫反应产物明显高于模型组，其中全方组和拆方1号组作用最为显著，且两组无明显差异。说明脑尔康方及拆方1号组促进了海马区和皮质突触素表达，提示拆方1号及脑尔康改善AD小鼠学习记忆能力的机制，可能是通过增加突触素的含量和突触的数量促进皮质和海马内突触重建和改建发挥脑保护作用。本实验通过拆方研究对复方中药脑尔康进行精简，为进一步研制出处方更加精炼、效果更加显著的抗痴呆新药提供实验依据。

［1］ 李 玺，乔成林，张雪飞.脑尔康对老年痴呆小鼠脑内胆碱酯酶活性及神经元影响 ［J］.西安医科大学学报，2011，22（2）：17－19.

［2］ 李 玺，张英泽，乔成林.脑尔康对AD模型小鼠脑内一氧化氮合酶活性的影响 ［J］.中国老年学杂志，2012，22（10）：75－76.

［3］ 袁海峰，李 玺，张智燕.脑尔康对AD模型小鼠脑内APP，Aβ表达的影响 ［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（24）：140－142.

［4］ 马新欣，李 玺，侯吉星，等.脑尔康及其拆方组队阿尔茨海默病小鼠模型脑内BDNF表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（22）：227－232.

［5］ 杨开艳.阿尔茨海默病模型建立及干预实验研究进展［J］.南通大学学报：医学版，2007，27（2）：151.

［6］ 刘 晴，施建蓉.中药复方拆方研究［J］.中西医结合学报，2013，9（1）：173.

［7］ Blennow K，De Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer’s disease［J］.Lancet，2006，368（9533）：387－403.

［8］ Jeynes B，Provias J.Evidence for altered LRP／RAGE expression in Alzheimer＇s lesion pathogenesis［J］.Curr Alzheimer＇s Res，2008，5（5）：432－437.

［9］ Lue LF，Walker DG，Jacobson S.Receptor for advanced glycation end products：its role in Alzheimer’s disease and other neurological diseases［J］.Future Neurol，2009，4（2）：167－177.