虎掌草醇提物抗肿瘤活性及免疫调节作用研究*

吴德松，刘 佳，韦 迪，赵道强，周铭涛，冯莉萍

(云南省药物研究所，云南白药集团创新研发中心，云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111)

·实验研究·

虎掌草醇提物抗肿瘤活性及免疫调节作用研究*

吴德松，刘 佳，韦 迪，赵道强，周铭涛，冯莉萍△

(云南省药物研究所，云南白药集团创新研发中心，云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111)

目的 观察虎掌草醇提物的抗肿瘤活性及对荷瘤小鼠免疫功能的影响，并对其安全性进行初步评价。方法 改良MTT法检测虎掌草醇提物对人HepG-2、K562、A549和PC-3细胞株的增殖抑制活性；采用小鼠移植性肿瘤模型，研究虎掌草醇提物对小鼠肝癌H22生长的影响；免疫器官称重法检测对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响；ELISA法检测荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-a水平；小鼠急性毒性试验初步评价虎掌草醇提物的安全性。结果 虎掌草醇提物在体外对人肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制活性，其IC50值均小于10 μg/mL；虎掌草醇提物1.0、2.0 g/kg剂量可明显抑制小鼠肝癌H22的生长，同时对小鼠体重无明显影响；虎掌草醇提物可明显提升小鼠胸腺指数和脾脏指数，可明显提升小鼠血清TNF-α和IL-2水平。虎掌草醇提物小鼠灌胃给药LD50为6.218 g/kg，95%可信限为5.104 g/kg～7.526 g/kg，其毒性可能涉及的组织、器官、系统为中枢神经、神经肌肉、自主神经和肺脏功能损伤。结论 虎掌草醇提物具有明显的体内、外抗肿瘤活性，其活性可能与增强动物免疫力，提升小鼠血清IL-2、TNF-α水平有关。

虎掌草；抗肿瘤；免疫调节

虎掌草(AnemonerivularisBuch.-Ham.)为毛茛科银莲花属植物草玉梅的根，主要分布于甘肃西南、青海、云南、四川、西藏等地，具有清热解毒、活血舒筋、消肿止痛等功效[1]，在《滇南本草》和《中华本草》中均有记载。据《云南中草药》记载，虎掌草在民间可用于癌症的治疗[2]，提示虎掌草可以具备一定开发价值。国内、外对其抗肿瘤活性研究还主要停留在体外活性研究方面，其体内抗肿瘤活性和安全性的研究鲜有报导。基于上述考虑，笔者对虎掌草提取物进行更深入的抗肿瘤活性研究及初步的安全性评价，希望为治疗恶性肿瘤提供一种有苗头的药物，为其进一步开发利用提供药效学研究基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康KM小鼠，全雌性，体重18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2008-0002。

1.2 细胞株与瘤株 人肝癌HepG-2、人慢性骨髓性白血病K562、人肺癌A549和人前列腺癌PC-3细胞株均购自中国科学院昆明细胞库。小鼠肝癌H22瘤株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.3 样品制备 取虎掌草药材打粉，5倍量的70%乙醇回流提取三次，合并滤液，滤液减压浓缩，真空干燥，粉碎，得到干浸膏，得率为31.1%，常温干燥密封保存。

1.4 仪器与试剂 AG-285型电子分析天平、DMIL-LED型倒置相差显微镜、Multiskan Go全波长酶标仪、AC2-6S1型Ⅱ级生物安全柜、CCL-170A型CO2培养箱、3K15型台式冷冻高速离心机、DW-86L486超低温冰箱。Mouse IL-2、TNF-α ELISA试剂盒均购自美国R&D公司，MTT购自Sigma公司。

2 实验方法

2.1 对人肿瘤细胞株的增殖抑制作用 采用改良MTT法[3]检测受试物对人肿瘤细胞株的增殖抑制活性。取对数生长期细胞90 μL/孔接种于96孔板，浓度分别为5×104个/mL(贴壁细胞)和1×105个/mL(悬浮细胞)，贴壁细胞培养24 h后(悬浮细胞接种后即加药)加入不同浓度的受试物溶液10 μL(终浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL)，每个浓度设3个复孔，并设溶媒对照孔及无细胞调零孔。受试物与细胞共孵育48～72 h 后加入MTT，继续培养4h，加入三联液(10% SDS-5%异丁醇-0.01 mol/L HCl)50 μL/孔，于CO2培养箱中孵育过夜，用酶标仪于570 nm处测定吸光度。按下列公式计算肿瘤生长抑制率，并采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC50值，试验重复3次。

2.2 对小鼠移植瘤的生长抑制作用和免疫调节作用 参考文献[4]方法，将处于对数生长期的小鼠肝癌H22肿瘤细胞计数后，用无菌生理盐水调细胞浓度为1×107/mL浓度，接种于小鼠右侧腋部皮下，0.2 mL/只。取接种24h后的小鼠50只，随机分为溶媒对照组(纯水)、环磷酰胺组(20 mg/kg)和虎掌草醇提物0.5、1.0、2.0 g/kg剂量组，每组10只。其中环磷酰胺以0.1 mL/10 g腹腔注射给药，其余各组均以0.2 mL/10 g灌胃给药，每天1次，连续10d。第11d称量小鼠体重，摘眼球取血，3000 r/min离心10 min，取上清并参照ELISA试剂盒操作步骤，检测小鼠血清 IL-2、TNF-α；颈椎脱臼处死，剖取肿瘤称重，按下列公式计算抑瘤率；剖取动物胸腺和脾脏称重，按下列公式计算脏器指数[5]

2.3 小鼠急性毒性试验 参考文献[5]方法，将70只KM小鼠随机分为7组，即溶媒对照组(纯水)和虎掌草醇提物11.20，8.96，7.17，5.74，4.59和3.67 g/kg剂量组，每组10只，雌雄各半。禁食不禁水约6 h后，各剂量组均以40 mL/kg灌胃给予虎掌草醇提物不同浓度溶液1次，阴性对照组同法给予纯水1次。给药当天连续观察4 h动物出现的各种毒性反应、症状及死亡情况，以后每天观察1次，连续14 d；于给药第3、7、14 d称量体重；观察结束后处死动物，大体解剖观察各组动物脏器、器官的体积、颜色、质地等有无明显异常。采用Bliss法计算虎掌草醇提物小鼠急性毒性的LD50及95%可信限。

3 结果

3.1 对人肿瘤细胞株的增殖抑制作用 结果显示：虎掌草醇提物对人HepG-2、K562、A549和PC-3细胞株具有明显的增殖抑制活性，且结果呈现一定的剂量-效应关系。其IC50值分别为(6.56±1.23)μg/mL、(4.13±0.96)μg/mL、(6.46±1.77)μg/mL、(7.30±1.56)μg/mL，结果见图1。

图1 虎掌草醇提物对人肿瘤细胞株的增殖抑制活性

3.2 对小鼠荷瘤小鼠体重及肿瘤生长的影响 与溶媒对照组比较，环磷酰胺组小鼠体重明显下降(P<0.01)，虎掌草醇提物各剂量组对小鼠体重均无明显影响(P>0.05)。与溶媒对照组比较，虎掌草醇提物1.0 g/kg剂量组小鼠的平均瘤重明显减轻(P<0.05)，虎掌草醇提物2.0 g/kg剂量组小鼠的平均瘤重明显减轻(P<0.01)，结果见表1。

表1 虎掌草醇提物对小鼠移植性肝癌H22生长的影响±s)

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.3 对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响 与溶媒对照组比较，环磷酰胺组小鼠脾脏指数和胸腺指数明显下降(P<0.01)。虎掌草醇提物2.0 g/kg剂量可明显提升小鼠胸腺指数和脾脏指数(P<0.05)，结果见表2。

表2 虎掌草醇提物对小鼠免疫器官指数的影响±s)

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.4 对小鼠血清IL-2、TNF-α水平的影响 与溶媒对照组比较，虎掌草醇提物1.0、2.0 g/kg剂量组小鼠血清TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与溶媒对照组比较，虎掌草醇提物2.0 g/kg剂量组小鼠血清IL-2水平显著升高(P<0.05)，结果见表3。

表3 虎掌草醇提物对小鼠血清TNF-α、IL-2水平影响

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.5 急性毒性试验 虎掌草醇提物小鼠灌胃给药LD50为6.218 g/kg，95%可信限为5.104 g/kg～7.526 g/kg。受试动物的主要毒性反应为不进食、俯卧、运动减少、腹泻、竖毛、紫绀、运动失调、呼吸困难、抽搐等症状。实验期间，于给药后第3、7、14天对各剂量组存活动物称重，各组小鼠体重均持续增长，与溶媒对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。据毒性反应结果推测其毒性可能涉及的组织、器官、系统为中枢神经、神经肌肉、自主神经和肺脏功能损伤，结果见表4和表5。

表4 虎掌草醇提物小鼠急性毒性试验急性动物体重(♀/♂)

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

表5 虎掌草醇提物小鼠灌胃急性毒性试验动物的毒性反应(♀/♂)

4 讨论

虎掌草是云南民间常用药，可用于治疗喉蛾、痄腮、瘰疬结核、痈疽肿毒、疟疾、风湿疼痛、胃痛、跌打损伤等疾病，在民间可用于癌症的治疗。为了进一步开发利用本植物，我们对其体内、外抗肿瘤活性、免疫调节作用和急性毒性进行了研究。结果表明，虎掌草醇提物可明显抑制4种人肿瘤细胞株的增殖和小鼠肝癌H22肿瘤的生长、明显提升小鼠胸腺和脾脏指数，并能通过提升小鼠血清中TNF-α和IL-2水平，对肿瘤细胞产生直接或间接杀伤作用。本实验研究为虎掌草的产品开发和临床应用提供了实验基础。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：科学技术出版社，1999.3·164～3·166.

[2]云南省卫生局革命委员会.云南中草药[M].昆明：人民出版社，1971.470～471.

[3]甄永苏.抗肿瘤药物研究与开发.第1版[M].北京：化学工业出版社，2004：721～729.

[4]徐叔云，卞如濂，陈修.药理试验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2006：1766.

[5]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2006：108-109.

Study on the Anti-tumor Activity and Immunomodulatory Effect of Alcohol Extraction ofBrookAnemone

WU De-song, LIU Jia, WEI Di, ZHAO Dao-qiang, ZHOU Ming-tao, FENG Li-ping

(YunnanInstituteofMateriaMedica;InnovationandDevelopmentCenter,YunnanBaiyaoGroup;KeyLaboratory,YunnanNewMedicineDevelopmentBusinessofTraditionalChineseMedicineandEthno-Medicine,Kunming650111,Yunnan)

Objective: To observe the anti-tumor activity of alcohol extraction ofBrookAnemoneand its effect on the immunity of tumor-bearing mice. Methods: MTT was modified to detect alcohol extract ofBrookAnemoneon the proliferation inhibitory activity of Hep G-2, K562, A549 and PC-3 cell line of people. Tumor transplanted mice model was used to study the influence of the alcohol extract ofBrookAnemoneon the growth of liver cancer H22. Immune organ weight was used to detect immune organ index of the tumor-bearing mice; ELISA method to detect their serum IL-2 and TNF-a levels; the acute toxicity test preliminarily to evaluate the safety ofBrookAnemone. Results: The alcohol extract ofBrookAnemonehad a significant growth inhibitory activity in vitro for human tumor cell lines and its IC50values were less than 10 μg/mL. The 1.0, 2.0 g/kg dose of alcohol extract significantly inhibited H22liver cancer growth of the mice, but no obvious effect on body weight of the mice.BrookAnemonecan significantly raise the thymus index and spleen index and the serum TNF-α and IL-2 levels. When the mica were given intragastric infusion of alcohol extract LD50 6.218 g/kg, 95% confidence interval was 5.104 g/kg ～ 7.526 g/kg. Its tissue toxicity may be involved in the central nervous, neuromuscular and autonomic nerve injury and lung function impairment of organs, central nervous system and nerves muscle. Conclusion: The ethanol extract ofBrookAnemonehas obvious anti-tumor activity in vivo and in vitro and its activity may be related to the improvement of animal immunity and the serum IL-2 and TNF-α level of the mice.

BrookAnemone, anti-tumor, immunomodulatory

云南省应用基础研究计划项目青年基金：两种天然药物的抗肿瘤、心血管活性筛选研究(NO：2012FD074)

吴德松，男，河南洛阳人，硕士，工程师，主要从事天然药物筛选研究与开发工作，E-mail：wudesong14@163.com。

△通信作者：冯莉萍，E-mail：kongzhongdefeiyu@126.com。

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1007-2349(2015)07-0058-03

2015-04-13)