氨基酸转运载体LAT1对小鼠胎盘早期建立的影响

马婧，谭毅，谭冬梅，卢俊杰，梁浩，罗文萍

(1.重庆医科大学实验动物中心，重庆 400016;2.重庆医科大学附属口腔医院，重庆 401147;3.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆 401147)

在哺乳动物胚胎的植入过程中，胚外滋养层对子宫蜕膜的适度侵袭是成功植入的重要事件。该过程受到严格的时空调节，侵袭时间的早晚、侵袭程度的强弱都可能影响早期胎盘形成，甚至导致整个妊娠事件的成败。在小鼠围植入期，靠近内细胞团(inner cell mass)的细胞增殖分化形成绒毛膜锥(ectoplacental cone，EPCs)，绒毛膜锥的外层细胞分化为具有侵袭性的次级滋养层细胞(trophoblast giant cells，TGCs)，随后侵入母体蜕膜组织，形成胎盘。小鼠的滋养层细胞侵袭开始于D8［1，2］。小鼠作为研究人类滋养层细胞侵袭和胎盘早期发生的理想动物模型［3］，小鼠妊娠第8天时外胎盘锥中相关调节因子的表达规律及作用机制一直受到研究者的广泛关注，而L型氨基酸转运载体1(L－type amino acid transporter 1，LAT1)在小鼠早期胎盘发生过程中的作用尚鲜有报道。

氨基酸是构成蛋白质的基本元件，而氨基酸转运载体除了可以将氨基酸转移进出细胞外，还可参与氨基酸对神经细胞兴奋、抑制等重要细胞功能的调节过程［4］。L型氨基酸转运载体系统是一个非Na+依赖性的大中性氨基酸转运载体［5］，作为其中的一员，L型氨基酸转运载体1主要负责转运一些Na+非依赖性大中性氨基酸，其中包含亮氨酸、赖氨酸等必需氨基酸。亮氨酸作为LAT1的转运底物，在一定范围内其浓度升高时，LAT1表达水平增加，从而促进转运速度。而BCH作为转运抑制剂能够抑制LAT1的活性，从而调控氨基酸的转运。亮氨酸和BCH的抑制作用均受浓度和时间的双重调控。研究者发现，LAT1大量表达于小鼠胎盘组织［6］，推测其可能与胎儿发育过程中的氨基酸吸收和营养代谢相关［7］，比如胎儿从母体摄取重要氨基酸(如丝氨酸)［8］、激素(如甲状腺激素)等过程可能都依赖于LAT1的参与。LAT1功能的异常或可影响胎儿发育过程中氨基酸的正常吸收，甚至导致严重的代谢障碍性疾病。除此以外，鉴于在胎盘中LAT1主要表达在与侵袭表型相关的滋养层细胞［9，10］，我们推测LAT1或许也可参与滋养层侵袭行为的调节，进而影响胎盘发生过程。因此，我们检测了LAT1在D8小鼠子宫中的表达，并通过体外检测BCH和亮氨酸对EPCs外延生长的影响，探讨LAT1在早期胎盘形成中的作用，促进我们对胎盘形成过程中分子调节机制的进一步认识。

1 材料和方法

1.1 材料

6－8周龄SPF级KM雌鼠120只，体重20～25 g，购自重庆医科大学实验动物中心【SCXK(渝)2012－0001】，饲养及实验动物操作均于重庆医科大学实验动物中心动物屏障系统环境内【SYXK(渝)2012－0001】。KM 雄鼠与动情期雌鼠1∶2合笼，第2天早晨观察到阴栓的记为妊娠第1天(D1)。D8取材，收集子宫组织，将组织放入液氮中速冻，然后放在－80℃低温冰箱内保存，用于制作冰冻切片。

兔源性LAT1多克隆抗体购自Santa Cruz公司;兔SP检测试剂盒(SP－9001)、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Matrigel Basement Membrane Matrix基质胶购自美国 BD Biosciences公司;BCH、亮氨酸均购自Sigma公司;Gibco胎牛血清、Gibco F－12培养基均购自 Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测LAT1在D8小鼠子宫中的表达

妊娠小鼠D8的子宫组织冰冻切片进行免疫组织化学染色:3%H2O2甲醇溶液孵育20 min，山羊血清封闭30 min，一抗(浓度为1∶800的兔源性LAT1多克隆抗体;阴性对照组采取同种兔正常血清代替一抗)4℃孵育过夜，第2天滴加二抗山羊抗兔IgG，室温孵育1 h，然后滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液(S－A/HRP)室温孵育30 min，用DAB试剂显色，并用苏木精复染，盐酸酒精分化，梯度脱水，封片。显微镜下观察LAT1在妊娠小鼠D8子宫中的表达位置。

1.2.2 体外检测BCH以及亮氨酸对绒毛膜锥(EPCs)黏附能力及外延生长的影响

每次取20只孕鼠，每组5只。参考Peng等［11］方法分离D8.5的EPCs。断颈椎处死妊娠D8.5的小鼠，小心用剪刀和镊子打开子宫壁，取出鼓包，放入培养基中清洗，然后在显微镜下用眼科镊分离出EPCs，每只获取6～8个结构完整的EPCs，并随机将EPCs放到铺有Matrigel胶的24孔板中培养。2～4 h后，加入完全培养基(F12+10%FBS)。BCH及亮氨酸的处理浓度参考Chrostowski［9］文献报道，其中处理组分别加入0.1、1、4 μmol/L BCH。对照组不做处理。亮氨酸处理实验取材和方法同BCH处理。处理组亮氨酸浓度分别为:20、200、800 μmol/L。

观察各组EPCs黏附及外延生长的情况。EPCs的黏附情况及外延生长的测定参考Peng等方法。将培养至24、48 h的EPCs轻微晃动20 s，观察，依然在Matrigel胶上不动的EPCs记为黏附成功，并在显微镜下拍照，测量EPCs距离。每组实验重复3次。

1.2.3 统计学方法

所有实验数据采用平均值±标准差表示，使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析，组间比较采用t检验或方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测LAT1在D8小鼠子宫中的表达

免疫组织化学结果显示，LAT1强表达于D8小鼠子宫蜕膜区域的细胞中，并且LAT1在EPCs中呈现阳性表达(图1)。

2.2 亮氨酸对绒毛膜锥黏附及外延生长能力的影响

为了探讨LAT1的作用底物亮氨酸对EPCs侵袭能力的影响，我们检测了 20、200、800 μmol/L 亮氨酸对EPCs黏附能力及对外延生长的影响。结果，在培养至24 h及48 h时，不同组的EPCs的黏附率均在90%以上，各组之间差异无显著性。提示亮氨酸对EPCs的黏附能力没有影响。用ImageJ软件对EPCs外延生长距离分析可知，24 h及48 h时，不同浓度亮氨酸均对EPCs的外延生长无影响(图2)。

2.3 氨基酸转运抑制剂BCH对绒毛膜锥黏附及外延生长能力的影响

为了探讨氨基酸转运抑制剂BCH对EPCs侵袭能力的影响，我们检测了 0.1、1、4 μmol/L BCH 对EPCs黏附能力及对外延生长的影响。结果，在培养至24 h及48 h时。不同组的EPCs黏附率均在90%以上，各组之间差异无显著性。提示了BCH信号对EPCs的黏附能力没有影响。用过ImageJ软件对EPCs外延生长距离分析可知，在24 h 时，1、4 μmol/L BCH均可抑制EPCs的外延生长，与对照组比较，差异有显著性 (P ＜0.05)，在48 h时，0.1、1 μmol/L 可显著抑制EPCs的外延生长(P＜0.05)(图3)。

注:A:LAT1在D8子宫中表达;B:图A中EPCs放大;C:阴性对照;SDZ:次级蜕膜带;EPCs:绒毛膜锥。图1 免疫组化检测LAT1在D8小鼠子宫中的表达Note.A:LAT1 expression in the mouse uteri on day 8;B:A higher magnification of EPC in(A);C:negative control;SDZ:Secondary decidual zone;EPCs:Ectoplacental cone.Fig.1 Immunohitochemical staining of LAT1 in the mouse uteri on D8 of pregnancy.

注:A－D:对照组，20、200 、800 μmol/L 亮氨酸。图2 48 h时，不同浓度亮氨酸对EPCs外延生长能力的影响Note.A－D:Control，20，200，800 μmol/L L－leucine.Fig.2 Effects of different concentrations of L－leucine on EPCs outgrowth at 48 h

注:A－D:48 h时，EPCs外延生长图，分别为:对照组，0.1、1、4 μmol/L BCH;E:外延生长统计图;*P ＜0.05，与对照组比;＊＊ P ＜0.01，与对照组比。图3 不同浓度BCH对EPCs外延生长能力的影响Note.A－D:At 48 h，the outgrowth length of EPCs，Respectively，Control，0.1 μmol/L，1 μmol/L，4 μmol/L BCH;E:Statistics of the outgrowth length in different treatment groups;*P＜0.05，Compared with the control group;＊＊ P＜0.01，Compared with the control group.Fig.3 Effects of different concentrations of BCH on EPCs outgrowth

3 讨论

作为构成蛋白质的基本元件氨基酸参与了细胞内许多代谢途径，而氨基酸转运蛋白为氨基酸的摄取提供了载体通道。其中LAT1大量表达在胎儿脑、肝脏、骨髓、胎盘及生殖器等正常组织以及癌细胞中［12］，组织部位、细胞类型的不同导致表达水平不同［13］。

滋养层细胞侵入母体子宫发生蜕膜化是胚胎植入的关键步骤，在这一过程中，侵袭性的滋养层细胞的侵袭能力和行为方式与肿瘤细胞相似，此过程均涉及基质金属蛋白酶、激素以及母体免疫、代谢及内分泌等活动的调节［14，15］。因此，从某种意义上讲，滋养层细胞对母体蜕膜侵入的精确调控与肿瘤细胞侵袭的失控是同一种细胞行为的两种表型［14］。有研究报道，LAT1在滋养层细胞株Rs26 TS细胞中高表达，采用基因沉默或者是LAT1的拮抗剂BCH干预细胞，均可降低小鼠滋养层细胞株Rs26 TS细胞侵袭［16］。因此，LAT1在小鼠胎盘组织中的高表达可能是通过参与调节滋养层细胞侵袭行为进而影响早期胎盘发生进程。

在本实验中，我们检测了LAT1在小鼠滋养层细胞对子宫内膜开始侵袭时(即妊娠第8天)妊娠子宫中的表达，结果证实，LAT1强表达于次级蜕膜带的蜕膜细胞胞膜上以及侵袭性的EPCs中。在胎盘未形成之前，大核多核的蜕膜细胞可为胚胎的生长提供能量，因此LAT1在次级蜕膜带的强表达可能提示其在胚胎发育中的营养作用。为了进一步验证LAT1在EPCs侵袭过程中所扮演的角色，我们选择体外分离培养的D8.5的EPCs作为研究小鼠胚胎植入及滋养层侵袭的体外模型，将EPCs种植于Matrigel胶上，并分别以不同浓度的LAT1的氨基酸作用底物亮氨酸及氨基酸转运抑制剂BCH进行干预。在小鼠滋养层细胞株Rs26 TS的完全培养基中含有200 mg/L亮氨酸，而研究发现在较低浓度(40 μmol/L)的亮氨酸培养基培中，细胞LAT1 mRNA和蛋白表达水平均升高。因此，限制亮氨酸的浓度可以改变LAT1的表达水平。在EPCs培养的F12完全培养基中加入不同浓度的亮氨酸，直至将培养基中亮氨酸浓度额外增加至800 μmol/L(200 mg/L)的浓度，依然没有发现EPCs的粘附及外延生长能力受到影响。分析原因，可能是因为在完全培养基中，氨基酸浓度(包括亮氨酸)非常高，因此再额外的添加亮氨酸，已经不能改变LAT1的表达水平，这也与本文中亮氨酸处理EPCs后外延生长情况无显著性差异的检测结果相吻合。如果要更进一步的研究LAT1的作用底物在EPCs的粘附及外延生长能力方面的影响，应该自制选择性培养基，去除F12完全培养基中的LAT1底物氨基酸，再给予定量添加。

BCH为LAT1转运亮氨酸的竞争性抑制剂。在肿瘤细胞中，BCH可能通过影响氨基酸的胞内转运，影响mTOR磷酸化及其下游信号，进而通过转录后修饰调节等方式改变 LAT1的表达水平［16］。我们采用不同浓度的氨基酸特异抑制剂BCH处理EPCs，结果提示，在 24 h 时，1、4 μmol/L BCH 均可显著抑制 EPCs的外延生长，而在48h时，0.1、1 μmol/L可表现出显著的抑制作用，4 μmol/L组的抑制作用差异不显著。在加入亮氨酸及BCH处理EPCs后，无法从Matrigel胶上分离出外延生长的滋养层细胞，因此无法检测该细胞中LAT1的表达水平是否发生变化。有文献报道在Rs26 TS细胞中，BCH对LAT1的表达水平改变能力尚不如亮氨酸的作用。BCH作用48 h时，LAT1的蛋白表达水平无显著变化，但依然可以发现Rs26 TS细胞的侵袭能力产生了显著变化。

因此我们推测LAT1可能促进EPCs的外延生长从而参与胎盘的形成。但LAT1通过何种分子机制参与调节EPCs的侵袭行为，以及在体内以何种复杂方式参与早期胎盘的发生，仍需进一步实验研究。

［1］Erica DW，Cross JC.Development of structures and transport functions in the mouse placenta ［J］.Physiology，2005，20:180－193.

［2］Lagu MN，Detmar J，Paquet M，et al.Decidual PTEN expression is required for trophoblast invasion in the mouse［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，299(6):936－946.

［3］Hu D，Cross JC.Development and function of trophoblast giant cells in the rodent placenta［J］.Int J Dev Biol，2010，54(2 －3):341－354.

［4］魏宗友，徐柏林，郝志敏，等.氨基酸转运载体的研究进展［J］.中国饲料，2010，(13):19－23.

［5］Imai H，Kaira K，Oriuchi N，et al.L－type amino acid transporter 1 expression is a prognostic marker in patients with surgically resected stage I non－small cell lung cancer［J］.Histopathology，2009，54(7):804－813.

［6］Yanagida O，Kanai Y，Chairoungdua A，et al.Human L－type amino acid transporter(LAT1):characterization of function and expression in tumor cell lines ［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1514(2):291－302.

［7］Aiko Y，Askew1 DJ，Aramaki S，et al.Differential levels of amino acid transporters system L and ASCT2，and the mTOR protein in placenta of preeclampsia and IUGR［J］.BMC Pregnancy Childbirth.2014，14:181.

［8］Lewis RM，Glazier J，Greenwood SL，et al.L－serine uptake by human placental microvillous membrane vesicles［J］.Placenta，2007，28(5－6):445－452.

［9］Chrostowski MK，McGonnigal BG，Stabila JP，et al.LAT1 expression in pre and post implantation embryos and placenta［J］.Placenta.2009，30(3):270－276.

［10］Jones H，Crombleholme T，Habli M.Regulation of amino acid transporters by adenoviral－mediated human insulin－like growth factor－1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro［J］.Placenta，2014，35(2):132－138.

［11］Peng S，Li J，Miao C，et al.Dickkopf－1 secreted by decidual cells promotes trophoblast cell invasion during murine placentation［J］.Reproduction，2008，135(3):367 －375.

［12］吴信，褚武英，石常友，等.氨基酸转运载体LAT1研究进展［J］.生命科学.2008，20(2):253－257.

［13］Kaira K，Oriuchi N，Imai H，et al.L－type amino acid transporter 1 and CD98 expression in primary and metastatic sites of human neoplasms［J］.Cancer Sci，2008，99(12):2380 －2386.

［14］Estella1 C，Herrer I，Atkinson SP，et al.Inhibition of histone deacetylase activity in human endometrial stromal cells promotes extracellular matrix remodelling and limits embryo invasion［J］.PLoS ONE，2012，7(1):305－308.

［15］Godbole G，Suman P，Gupta SK，et al.Decidualized endometrial stromal cell derived factors promote trophoblast invasion ［J］.Fertil Steril，2011，95(4):1278 －1283.

［16］Chrostowski MK，McGonnigal BG，Stabila JP，et al.Role of the L－amino acid transporter－1(LAT1)in mouse trophoblast cell invasion［J］.Placenta，2010，31(6):528 －534.

［17］Yamauchi K，Sakurai H，Toru Kimura T，et al.System L amino acid transporter inhibitor enhances anti－tumor activity of cisplatin in a head and neck squamous cell carcinoma cell line［J］.Cancer Lett，2009，276(1):95 －101.