鼠类膝骨关节炎模型评价方法现状分析

周凯等

【摘 要】 膝骨关节炎为临床常见疾病，目前对其病理生理变化、发病机制的认识仍然不甚明了，而动物膝骨关节炎模型是膝骨关节炎防治研究的重要手段。目前，医学界对动物膝骨关节炎模型建立的具体方法讨论较多，但对采用何种动物模型评价标准仍然缺乏统一的观点，常采用的实验动物为鼠和兔。文章就鼠类膝骨关节炎模型评价方法作一总结。

【关键词】 骨关节炎，膝；鼠类；模型；评价方法

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.07.018

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是临床常见的退行性关节疾病，随着我国人口老龄化加剧，KOA发病率也随之增高。目前，医学界对KOA的认识尚未明了，直接在人类身体基础上探究其病理生理变化、发病及防治机制具有极大的局限性，且与人类伦理冲突。因此，对KOA防治机制的探索在极大程度上依赖动物模型。在实验动物的选择上，由于鼠类关节组织结构与人类相近，且在罹患KOA时实验室指标及形态学方面与人类患者类似，符合相关性、适当性、实用性原则，因而临床上选用鼠类建立KOA模型较多[1-2]。鼠类KOA模型根据建模方法的不同可分为自发性模型及诱发性模型两大类，前者是指实验鼠不接受任何有意识的人为干预，在自然情况下所发生的KOA，抑或是由于基因变异并通过遗传育种技术，传代保留下来的骨关节炎（osteoarthritis，OA）动物模型：STRPort小鼠和Hartley 豚鼠等；而诱发性模型是指通过各种人为操作诱导产生的OA动物模型，包括Hulth法和半月板不稳定术等。目前国内外研究中对动物KOA模型建立方法的探讨较多[3]，具体建模方法已经颇为成熟。然而，在相关论述中，讨论评价动物模型建立成功与否的方法却显得相对较少。能否恰当地选择评价标准，往往可能左右整个实验研究结果。本文对鼠类KOA模型评价方法作一综述，以期为同道选择运用评价方法时提供参考。

1 活体观察指标评价

有研究者认为，建模后可通过直接观察活体实验鼠类膝关节局部状况、步态改变及关节活动的变化[4]或直接以游标卡尺测量关节肿胀程度[5]，并与建模前的数据进行对比，来判断造模是否成功。如需对上述观察指标进行量化，则可在记录上述观察指标后，运用Lequesne MG[6]进行评分。在行为学指标上可观察实验鼠类在建模前后，活动时步态及休息时体位有无变化，活动有无增减，活动灵活性是否降低以及进食的时间，进食总量是否受到影响，以判断实验鼠类模型是否成功[7]。也有学者把鼠类膝关节外观分级，协助判断KOA模型的程度，如平均关节炎指数（MAI）采用关节炎评分（0～4分共5级）：0分，无关节炎；1分，关节有红色斑点或轻度肿胀；2分，关节中度红肿；3分，关节重度红肿；4分，关节严重红肿且不能负重。每只实验鼠类的关节炎评价分数为四肢关节评价分数之和[8]。通过活体观察、行为学及外观的观察可在不对实验鼠类造成损伤的情况下，对KOA模型成功与否进行初步判断，更符合客观实际，可充分还原人类患病后诊疗过程。但此类指标相对缺乏具体、客观的标准，在KOA定性上尚可，但在KOA病理分期上相对较差，且由于鼠类个体较小，干扰因素较多，导致上述观察指标在鼠类模型上的采集有一定的难度。

2 病理学观察指标评价

2.1 大体观察 大体观察指标可在处死实验鼠类后行病理取材，将所取标本置于显微镜下进行观察。主要观察目标包括：鼠类膝关节表面光滑度、透明度及色泽，关节表面有无新生物，关节软骨表面是否有裂隙、软化或溃疡等，还应观察软骨的缺损程度，软骨下骨是否存在裸露情况[9]。具体评分标准如下（0～4分共5级）：0分，关节面光整，色泽如常；1分，关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2分，关节面糜烂，软骨缺损深达软骨浅中层；3分，关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；4分，软骨剥脱，软骨下骨质暴露[10]。还可在显微镜下观察膝关节的滑膜增生情况，软骨磨损程度及周围骨赘形成数目等内容[11-12]，上述观测指标对KOA鼠类模型具有确切的指示作用，能具体观察到实验鼠类KOA病变程度，且操作简单，对实验室资源消耗较小。但此类评价方法均为离体观察法，必须处死实验动物，有一定的局限性。

2.2 组织和细胞学观察 组织和细胞学观察法是在处死实验鼠类后，切取部分膝关节软骨，将标本制成切片后置于光镜下观察软骨组织的层次、软骨细胞及软骨基质、潮线等的变化，并进行Mankin's评分[13]或改良Mankin's评分[14]以量化相关指标。Mankin's评分从整体结构、细胞结构、番红染色、潮线完整性4个方面分不同等级进行评分，最高14分，最低0分。0～1分为正常软骨；2～6分为早期OA；7～10分为中期OA；11～14分为晚期OA。但Mankin's评分建立于晚期OA病理模型且缺乏分期系统，对早期或轻微的OA不甚适用。

针对Mankin's评分系统的缺陷，国际OA研究学会建立的OOCHAS法对软骨组织病理学进行分级评分[15-16]。OOCHAS法将KOA分为以下7级：0级，软骨表面平整，软骨完整；1级，软骨表面浅层纤维形成，且不均匀；2级，软骨表面不连续，伴有细胞增殖，在Ⅱ～Ⅲ层异染物质增加或减少；3级，软骨皲裂扩散至Ⅲ层或出现侵蚀；4级，软骨侵蚀加重，关节软骨出现损害；5级，关节软骨剥脱；6级，关节变形。

Chambers评分[17]，切取关节取内、外侧股骨髁与内、外侧胫骨平台4个部分各12张切片，经番红O-固绿染色后，将标本置于光镜下对其进行观察。Chambers评分标准细则为：0分，正常软骨；0.5分，软骨正常，但软骨染色减弱；1分，关节表面平整，有少量纤维覆盖；2分，关节软骨浅层纤维组织覆盖，并且可见薄层软骨剥脱；3分，软骨层轻度磨损（< 20%全层软骨）；5分，软骨层中度磨损（20%～80%全层软骨）；6分，软骨层严重磨损（> 80%全层软骨）。

上述观察方法可对实验动物KOA进行量化，利于实验后期的数据统计分析，有很强的可操作性，但是此类方法观察指标过于细化，在组内以及组间差异经过重复观测后，可能导致差异相对较大，使实验结果产生偏倚。

2.3 免疫组织化学、Western blot及PCR观察 采用免疫组织化学、Western blot及PCR观测软骨中的目标基因如MMP、ZIP及Caspase等在退行性变软骨中的表达情况。观测结果判定可通过计算每个观察视野内阳性细胞数和细胞总数，目标基因的表达量用阳性细胞数占细胞总数的百分比进行量化[18]，具体标准为：0分，阴性；1分，阳性细胞数≤10%；2分，10%<阳性细胞数≤50%；

3分，50%<阳性细胞数≤75%；4分，阳性细胞数>75%。阳性细胞数评分乘染色强度评分即为乘积分数，将乘积分数≤4分定为阴性，> 4分定为阳性[19]。或者按切片的染色强度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为

3分[19]。此类观察方法针对性极强，在KOA相关机制研究中具有不可替代的作用，有望在KOA的发生、发展与治疗的研究中带来巨大契机；但其不是操作技术相对复杂且成本较高，对实验室的要求也相对较高。

2.4 超微结构观察 超微结构观察是指在电镜观察亚细胞结构、大分子水平的变化，用以了解组织和细胞最细微的病变。Lippiello等[20]报道，通过在实验动物食物中添加Omega-3脂肪酸，用以代替必需脂肪酸Omega-6会导致其软骨纤维变性，软骨超微结构退化。此方法可深入认识KOA的基本病变、病因和发病机制，但是目前在KOA动物模型研究中运用较少，经验相对缺乏。

2.5 细胞化学观察 将实验鼠类胫骨平台内侧软骨组织制备成适宜厚度冰冻切片后，经过一系列处理与干预，通过荧光显微镜观察细胞内锌离子、锰离子等的成像[21]。此类观察方法针对性极强，可运用于KOA相关机制研究中，但其缺点与免疫组织化学、Western blot及PCR观察相似。

3 影像学观察评价

核磁共振成像（magnetic resonance imaging，

MRI）检查，将实验鼠类麻醉后固定双膝，在核磁共振仪上进行双膝扫描检查，在鼠类股骨髁负重处软骨的3个不同地方进行测量，取其平均值[22-24]。

此方法可以在不对动物带来损伤的情况下，对KOA动物模型进行早期、精确的判断，尤其在关节软骨病变上具有特殊优势，此外，本检测方法还可对软骨下骨、骨髓、半月板、滑膜炎及关节渗出及肌腱功能不全等进行观察[25]。

X线检查，通过对实验鼠类双膝关节行X线检查膝关节内外侧间隙是否均匀一致，股骨髁、胫骨平台关节面轮廓清晰、光整，骨密度均匀

与否[26-27]，X线片是早期研究者证实关节炎表现最直接、最有效的工具[25]。

光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）具有较高的空间分辨率，可以实现对鼠类软骨形态的扫描[28]，但是此技术仅能提供二维图像，不利于对软骨形态进行整体评价。此技术改进为利用Micro-CT关节造影术（活体膝关节腔注射离子造影剂）扫描重建髌骨软骨，以观察离体鼠类髌骨软骨成分和形态学变化[29-30]；但是仍然存在图像为2D的问题。

由于OCT的不足，有学者主张采用增强纳米聚焦X 射线计算机断层成像（contrast enhanced nanofocus X ray computed tomography，CE nano CT），认为该法可对鼠类关节软骨和骨组织结构和生物化学等3D进行可视化同步成像和评价[31]。

4 实验室观察指标评价

大鼠血清iNOS、SOD浓度[32-33]，PⅡCP[34]及关节滑液内白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶-3和血清中丙二醛、一氧化氮含量[35]。此类检测指标较多，因具体实验与理论依据不同而不同，目前实验研究中运用较多，检查方法成熟，成本较低，但鼠类关节滑液标本选取相对困难。

5 讨 论

目前，医学界通过KOA动物模型对KOA的病因病机、防治方法做了大量的研究工作，也取得了阶段性的成果。对其发病机制认识及造模方式的选择，医学界至今尚未达成统一意见。KOA患者临床及病理表现复杂，在临床诊断及疗效评估中需要考虑患者症状、体征、生存质量等，目前KOA疗效评估已经有行业内认可的评分量表，但这些量表在观察指标上无法施行于实验动物的运用中。动物KOA模型评价方法主要由实验本身决定，如动物选择、观察指标、实验方法及设计等因素决定，因此，在评价的实际运用中，我们实时关注评价方法的进展，并根据自身研究的预期目的，结合实验观察目标、经费运算及实验室条件等来选择合理评价标准，以期获得最为理想的实验结果，为临床实践提供更好的支持。

6 参考文献

[1] Ashraf S，Mapp PI，Walsh DA.Contributions of angiogenesis to inflammation，joint damage，and pain in a rat model of osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2011，63（9）：2700-2710.

[2] Zhang R，Fang H，Chen Y，et al.Gene expression analyses of subchondral bone in early experimental osteoarthritis by microarray[J].PLoS One，2012，7（2）：e32356.

[3] Little CB，Smith MM.Animal Models of Osteoarthritis[J].Current Rheumatology Reviews，2008，4（4）：175-182.

[4] 戚晴雪，马玉峰，吴忌，等.低频超声促透通络止痛方对大鼠不同程度膝骨关节炎的影响[J].南京中医药大学学报，2014，30（3）：244-248.

[5] Bar-Yehuda S，Rath-Wolfson L，Del Valle L，et al.Induction of an antiinflammatory effect and prevention of cartilage damage in rat knee osteoarthritis by CF101 treatment[J].Arthritis Rheum，2009，60（10）：

3061-3071.

[6] Mitragotri S，Edwards DA，Blankschtein D，et al.A mechanistic study of ultrasonically-enhanced transdermal drug delivery[J].Pharm Sci，1995，84（6）：697-706.

[7] 伊明，熊辉，贺荔枝.用木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸建立大鼠膝关节骨关节炎模型的研究[J/OL].中国科技论文在线精品论文，2009，2（23）：2474-2479.

[8] 王岩峰，王喆，杨明超，等.吲哚美辛对大鼠骨关节炎模型关节软骨中IL-6表达的影响[J].热带医学杂志，2014，14（5）：660-663.

[9] 张荣凯，杨禄坤，叶志强，等.以关节不稳建立的大鼠骨关节炎模型[J].中国组织工程研究，2013，17（37）：6628-6635.

[10] 黄际河，陈蔚东，秦泗通，等.生物学因子p-p38、MMP-3、MMP-13对大鼠关节软骨的破坏作用[J].江苏医药，2010，36（2）：183-185.

[11] 刘文奇，刘洪波，刘娇莹，等.海南大驳骨对骨性关节炎模型大鼠膝关节软骨形态学的影响[J].海峡药学，2014，26（11）：41-42.

[12] 李涧，董启榕，谢宗刚，等.降钙素对骨关节炎大鼠关节软骨的影响[J].江苏医药，2014，40（1）：4-6.

[13] Beninghoff A.Form und Bau der gelenkknorpel in ihren Beziehungen zur funktion[J].

Z Zellforsch，1925，2（5）：783-862.

[14] Patel DV，Sawant MG，Kaur G.Evaluation of anti-osteoarthritic activity of Vigna mungo in papain induced osteoarthritis model[J].Indian J Pharmacol，2015，47（1）：59-64.

[15] 李文雄，孙赫，沈玮，等.SD大鼠骨关节炎造模方法的筛选及优化探究[J].畜牧与兽医，2014，46（10）：70-73.

[16] Pritzker KP，Gay S，Jimenez SA，et al.Osteoarthritis cartilage histopathology：grading and staging[J].Osteoarthritis Cartilage，2006，14（1）：13-29.

[17] Chambers MG，Cox L，Chong L，et al.Matrix metalloproteinases and aggrecanases cleave aggrecan in different zones of normal cartilage but colocalize in the development of osteoarthritic lesions in STR/ort mice[J].Arthritis Rheum，2001，44（6）：1455-1465.

[18] 钱洁，邢雪松，梁军.大鼠膝关节骨性关节炎动物模型的两种实验方案[J].实验室研究与探索，2014，33（11）：23-27.

[19] 李建柱，李宽新，郭二鹏，等.β-catenin在SD大鼠骨关节炎滑膜组织中的表达及意义[J]，南京医科大学学报：自然科学版，2015，35（2）：155-159.

[20] Lippiello L，Fienhold M，Grandjean C，et al.Metabolic and ultrastuctural changes in articular cartilage of rats fed dietary supplements of omega-3 fatty acids[J].Arthritis Rheum，1990，33（7）：1029-1036.

[21] Kim JH，Jeon J，Shin M，et al.Regulation of the catabolic cascade in osteoarthritis by the zinc-ZIP8-MTF1 axis[J].Cell，2014，156（4）：730-743.

[22] 马强，高永华.骨关节炎动物模型的生化及磁共振成像研究[J].中华风湿病学杂志，2005，9（8）：473-475.

[23] Kircher MF，Allport JR，Graves EE，et al.In vivo high resolution three-dimensional imaging of antigen-specific cytotoxic T-lymphocyte trafficking to tumors[J].Cancer Res，2003，63（20）：6838-6846.

[24] Lee JH，Dyke JP，Ballon D，et al.Assessment of Bone Perfusion with Contrast-Enhanced Magnetic Resonance Imaging[J].Orthop Clin North Am，2009，40（2）：249–257.

[25] 马玉峰，祁印泽，王庆甫，等.关节内注射药物建立骨性关节炎动物模型研究进展[J].中国骨伤，2015，28（1）：90-95.

[26] 孙先润，唐涛，李跃琼.SD大鼠膝前交叉韧带切断后骨关节的变化[J].中国矫形外科杂志，2013，21（22）：2294-2298.

[27] 闫美凤，姜楠，徐明智，等.痹痛康丸对胶原性关节炎大鼠IL-1β、IL-6的影响[J].风湿病与关节炎，2013，2（6）：22-25.

[28] Dam EB，Folkesson J，Pettersen PC，et al.Automatic morphometric cartilage quantification in the medial tibial plateau from MRI for osteoarthritis grading[J].

Osteoarthritis Cartilage，2007，15（7）：808-818.

[29] Thote T，Lin AS，Raji Y，et al.Localized 3D analysis of cartilage composition and morphology in small animal models of joint degeneration[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21（8）：1132-1141.

[30] 王江雪，高玉，李辉，等.离子造影剂增强Micro-CT扫描对大鼠关节软骨形态的定量分析[J].生物医学工程研究，2014，33（3）：157-161.

[31] Kerckhofs G，Sainz J，Wevers M，et al.Contrast enhanced nanofocus computed tomography images the cartilage subtissue architecture in three dimensions[J].Eur Cells Mater，2013（25）：179-189.

[32] 张俐，李芃，陈凯.去势大鼠劳损性膝骨关节炎新模型的建立[J].中国中医骨伤科杂志，2014，22（11）：1-3.

[33] 高宁阳，曹月龙，刘婷，等.C57黑鼠骨关节炎模型的关节病理积分与血清及滑膜中基质金属蛋白酶-3白细胞介素-1水平的相关性研究[J].中华风湿病学杂志，2010，14（3）：195-198.

[34] 钱春美，袁秀荣，文小平，等.芍药舒筋片对大鼠膝骨关节炎软骨病理及PⅡCP水平的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2103，21（3）：1-3.

[35] 霍康富，李楠，王和鸣.膝骨关节炎动物模型的研究进展[J].中国中医骨伤科杂志，2014，22（11）：68-71.

收稿日期：2015-04-09；修回日期：2015-05-20