rBMSC和rLFs做为韧带组织工程种子细胞的特性比较

张承昊，金 瑛，范青洪，孙鹏鹏，吴术红，刘 毅

(遵义医学院附属医院 骨一科，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

rBMSC和rLFs做为韧带组织工程种子细胞的特性比较

张承昊，金 瑛，范青洪，孙鹏鹏，吴术红，刘 毅

(遵义医学院附属医院 骨一科，贵州 遵义 563099)

目的 比较大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和韧带成纤维细胞(rLFs)做为韧带组织工程种子细胞来源的价值。方法 采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得rBMSCs，通过组织消化法获取培养rLFs。分别取第3代rBMSCs和rLFs，根据是否添加TGF-β1和bFGF-1生长因子诱导分为诱导组和非诱导组(共4组)。用MTT法检测细胞增殖情况，天狼猩红和固绿检测细胞总胶原蛋白量和总非胶原蛋白量，ELISA法检测细胞内外Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度，实时荧光定量PCR检测细胞韧带特异性基因Tnc、Fn1、Mmp2的mRNA表达水平。结果 rBMSCs原代时的活性和增殖能力高于rLFs，第3代rBMSCs未诱导组的细胞活性明显高于rLFs未诱导组(P<0.05)，且rBMSCs诱导组也明显高于rLFs诱导组(P<0.05)，2种细胞诱导后的细胞活性均比诱导前提高。细胞总胶原分泌量诱导前后rLFs均高于同条件下rBMSCs。诱导后细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度rBMSCs增长速度比rLFs快(P<0.05)，但其Ⅰ型胶原蛋白增长速度明显高于Ⅲ型胶原蛋白(P<0.05)，而rLFs两者成比例增长。诱导前后韧带特异性基因mRNA表达量以rBMSCs增长速度最快(P<0.05)，但诱导后的表达量仍未超过诱导后rLFs的表达。结论 rBMSCs具有较高的细胞活性和增殖能力，对外界诱导反应明显高于rLFs，但其韧带特异性基因的表达诱导前后均较rLFs低。

BMSC；LF；生长因子；韧带；组织工程

韧带组织工程研究中采用的细胞来源较多，主要包括各种来源的间充质干细胞、成熟体细胞和基因转染细胞等。间充质干细胞具有组织来源广泛、免疫原性低、细胞扩增能力强和易于诱导等优势；成熟体细胞具有细胞成熟，可分泌多种因子和韧带蛋白，不需要进行太多调整即可满足需要等特点。这两类来源细胞各有优势。本文从这2种来源细胞中各选取了1种细胞，即鼠源骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和韧带成纤维细胞(rLFs)，经培养和诱导后进行检测，比较2种来源细胞的活性，增殖，分泌特点及对诱导的反应，为今后选用2种细胞作为韧带组织工程应用研究的种子细胞来源提供有价值的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 清洁级SD大鼠，雌雄不拘，体重180～220 g,由第三军医大学实验动物中心提供。主要实验材料：Percoll分离液(Pharmacia公司)，胶原酶(上海铭睿生物科技有限公司)，rTGF-β1(Prime Gene Bio-tech Company)，rbFGF-1(Prime Gene Bio-tech Company),天狼猩红和固绿(宝信生物科技有限公司)，ELISA Collagen type Ⅰ、Ⅲ试剂盒(均为上海铭睿生物科技有限公司产品)，RNAisoPlus、逆转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqtTM(均为大连TaKaRa公司产品)。主要实验仪器：流式细胞仪(FACS Calibur,Becton Dickinson,USA)，逆转录仪(德国Eppendorf公司)，核酸蛋白测量ND-1000(美国Nanodrop公司)，实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)分离和培养 脱颈法处死大鼠，在无菌条件下取双侧股骨及胫骨，去除软组织和肌肉，含双抗的PBS溶液冲洗后再用含双抗的DMEM培养液漂洗。咬骨钳咬除干骺端，LG-DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，2000 rpm离心5 min，弃上清。加入LG-DMEM培养液吹打制成细胞悬液，贴壁轻轻加到Percoll分离液上层，2000 rpm离心20 min后，小心收集界面层细胞，添加PBS液离心洗涤2次，最后用含10%胎牛血清的LG-DMEM培养液重悬后接种到12.5 cm培养瓶中，37 ℃，5%CO2，饱和湿度的CO2孵箱中培养。3d后首次换液，此后每2～3天换液1次，传至第3代。流式细胞术检测rBMSCs表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34、CD45表达情况。

1.3 大鼠韧带成纤维细胞(rLFs)分离和培养 脱颈法处死大鼠，无菌条件下取大鼠膝关节双侧副韧带(LCL，MCL)、前后交叉韧带(ACL，PCL)。PBS液冲洗，剔除滑膜、脂肪等外周组织，PBS液冲洗，用眼科剪将韧带剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块。用DMEM溶解的胶原酶在37 ℃条件下震荡消化2 h后，吹打见无肉眼可见组织，加入完全培养基终止消化，1000 rpm离心10 min，PBS洗涤2次，用含10%胎牛血清的完全培养基吹打成细胞悬液，接种于预涂有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。培养48～72 h后首次换液，以后每2～3天换液1次。

1.4 实验分组及细胞诱导 取第3代rBMSCs和rLFs细胞，根据有无生长因子诱导分为非诱导组和诱导组，诱导组给予TGF-β1和bFGF-1各10 ng/mL的10%胎牛血清高糖DMEM培养液连续诱导培养12 d，每2～3天全量换液1次。实验分为rBMSCs未诱导组、rLFs未诱导组、rBMSCs诱导组、rLFs诱导组。

1.5 MTT法检测细胞生长活性 4组细胞传至第3代以每孔5×104个细胞/孔置于96孔板内培养，每孔加入500 μL培养液，每天换液，连续培养9 d，取5 mg/mL MTT溶液，每孔加入20 μL，避光孵育4 h，吸出培养液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，震荡溶解5 min，置酶标仪检测。

1.6 天狼猩红和固绿染色检测总胶原和总非胶原量 4组细胞传至第3代以每孔5×104/孔置于96孔板内培养，加入200 μL培养液，每天换液，连续培养12d后，吸出培养基，PBS洗2次，每孔内加入200 μL配好的含0.1%天狼星红和0.1%固绿的饱和苦味酸溶液，避光、旋转、振荡30 min，洗板至洗液无色，200 μL 0.1%NaOH-甲醇加入板内提色，吸光度540 nm及630 nm波长测定OA值。

1.7 ELISA法检测细胞内外Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度 取培养12 d细胞培养液和细胞，按照说明制定标准曲线，设置空白孔，加入样本。按照说明进行加样、温育、洗板、加酶、温育、洗板、显色、终止、测定，完成检测。

1.8 实时荧光定量PCR检测细胞韧带相关基因mRNA表达 取培养12 d细胞，RNAisoPLus提取总RNA，逆转录获得cDNA，设定引物序列(见表1)，按照定量PCR试剂盒说明配制PCR反应体系，扩增条件为：预变性95 ℃,5 s；变性95 ℃,5 s、退火 Tenascin-C 57 ℃，Fibronection 63 ℃，MMP-2 65 ℃，β-actin 55 ℃、延伸 72 ℃ 15 s，40个循环；以β-action做为内参，通过2-ΔΔCt法进行目标基因表达的相对定量计算分析。

表1 引物序列

目的基因基因编号引物序列扩增片段长度(bp)Tenascin-CNM＿053861．1上游引物：TTCAGTGTTGGAGATGCCAAGAG143下游引物：GCACAGTTGGTGATGGCTGAFibronectionNM＿019143．2上游引物：CATCAGCCCGGATGTCAGAA91下游引物：GGCATTGTCGTTGAGCGTGTAMMP2NM＿031054．2上游引物：TCCCGAGATCTGCAAGCAAG143下游引物：AGAATGTGGCCACCAGCAAGβ-actinNM＿031144．2上游引物：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA150下游引物：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG

2 结果

2.1 原代培养的rBMSCs与rLFs生长特点 原代培养的rBMSCs生长较rLFs快，大约取材后5 d rBMSCs开始明显加速，约生长到第8天可铺满瓶底；而原代培养的rLFs第7天才开始加快生长，12 d后才能铺满瓶底(见图1)。

A：rBMSCs原代细胞；B：rLFs原代细胞。

2.2 培养的rBMSCs表型特点 第3代rBMSCs经流式细胞仪检测其表型特征为表达CD29、CD73、CD90和CD105，不表达CD14、CD19、CD34、CD45(见图2)。

2.3 MTT法检测细胞活性 MTT检测4组细胞OD值分别为rBMSCs未诱导组：0.41±0.013，rLFs未诱导组：0.33±0.011，rBMSCs诱导组：0.50±0.008，rLFs诱导组：0.45±0.020。rBMSCs未诱导组明显高于rLFS未诱导组，rBMSCs诱导组明显高于rLFs诱导组，且2种细胞比较诱导组均高于非诱导组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.4 天狼猩红和固绿染色结果 诱导后2种细胞总胶原蛋白量和总非胶原蛋白量均提高，其中rBMSCS诱导组相对于rBMSCS未诱导组分别提高36.1%和27.3%，rLFs诱导组相对于rLFs未诱导组分别提高6%和3.3%，且rLFs诱导组仍高于rBMSCs诱导组，差异有统计学意义(P均<0.05)，见图3。

2.5 ELSIA法检测细胞内外Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度 未诱导组中除细胞外Ⅰ型胶原蛋白rLFS未诱导组低于rBMSCS未诱导组，其他3项均高于rBMSCS未诱导组。诱导组与非诱导组比rLFS诱导组均高于rLFS未诱导组，rBMSCS诱导组均高于rBMSCS未诱导组，但除细胞内Ⅰ型胶原蛋白外，rLFS诱导组均高于rBMSCS诱导组，差异有统计学意义(P均<0.05)，结果见表2。

2.6 实时荧光定量PCR检测4组细胞内韧带特异性基因 诱导组和非诱导组，除Tenascin-C基因rLFS诱导前后均低于rBMSCS组外，其他基因均以rLFs细胞表达量高，差异有统计学意义(P均<0.05)，见图4。

图2 rBMSCs表型的流式细胞术分析直方图

表2 ELISA检测细胞内外Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度

组别细胞内液I型胶原浓度细胞内液III型胶原浓度细胞外液I型胶原浓度细胞外液III型胶原浓度rBMSCS未诱导组5．75±0．00684．90±0．02505．05±0．02924．55±0．0335rLFS未诱导组6．35±0．00525．30±0．02094．80±0．05705．20±0．0711rBMSCS诱导组6．60±0．0083#5．25±0．0065#5．25±0．0337#4．90±0．0203#rLFS诱导组6．60±0．0104∗5．60±0．0528∗5．35±0．0158∗5．55±0．0067∗

与rLFS未诱导组、rBMSCS诱导组比较，*P<0.05，与rBMSCS未诱导组比较，#P<0.05。

与rBMSCS未诱导组比较，*P<0.05，与rLFS未诱导组、rBMSCS诱导组比较# P<0.05。

与rLFS未诱导组、rBMSCS诱导组比较，*P<0.05，与rBMSCS未诱导组比较，# P<0.05，与rLFS未诱导组、rLFS诱导组比较Δ P<0.05，与rLFS未诱导组比较ΔΔ P<0.05。

3 讨论

种子细胞是韧带组织工程学的主要组成部分，它除需具备可在支架上生存并增殖，以此逐渐替代支架结构，还需具备分泌韧带相关蛋白等的能力，以最终重建受损的韧带组织。目前，作为韧带组织工程种子细胞来源研究中，已涉及多种干细胞、成熟体细胞以及基因修饰干细胞的研究报道[1-4]，这些采用不同发育分化阶段细胞，不同技术策略的韧带损伤细胞治疗研究均获得了一定的疗效，但有关的治疗机制仍不清楚，且采用何种细胞更为合理也有待继续深入研究探讨。

本文选用了骨髓间充质干细胞和韧带成纤维细胞2个细胞来源代表进行比较研究，为今后韧带组织工程种子细胞选择提供实验研究依据。骨髓间充质干细胞具有来源广泛，取材比较方便，体外扩增能力强，免疫原性低，适宜条件下可多系分化的特点而应用前景广阔[5-7]。韧带成纤维细胞作为韧带内成熟的体细胞，能够分泌多种因子调节韧带组织代谢，修复重建韧带损伤，是良好的韧带组织损伤修复细胞选择[8-9]。在细胞活性和增殖能力比较中本实验发现，rBMSCs从原代开始细胞活性和增殖能力高于rLFs，原代rBMSCs进入对数期生长比rLFs提前2 d，第3代rBMSCs的OD值要比rLFs高24.2%。在细胞外液韧带特异性蛋白分泌比较中，培养12 d后第3代rLFs比rBMSCs分泌总胶原蛋白高出58.8%，总非胶原蛋白也高28.3%。细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成rLFs比rBMSCs分别高10.4%和8.2%。韧带特异性基因，Tenascin-C rBMSCs比rLFs高2.9倍，而MMP-2和Fibronectin的mRNA rLFs分别比rBMSCs高3.7倍和1.35倍。由于rBMSCs粘附性高，Tenascin-C是分布于细胞表面的粘附蛋白，其mRNA合成量要高于rLFs[10-11]。而MMP-2做为调节韧带组织胶原蛋白迁移和沉积的特殊因子[12-13]，Fibronectin做为构建韧带网络状结构的特殊蛋白，rBMSCs的基因表达明显低于rLFs[14-15]。

未诱导条件下rBMSCs具有较好的活性及增殖能力，而rLFs分泌韧带特异性蛋白的能力较rBMSCs高，可根据支架材料的不同特点选取细胞，也可以根据选用的细胞调节细胞周围的微环境，对细胞进行诱导和分化，调整细胞特性。

大部分可获得的细胞大多不能完全达到韧带组织工程学的要求，研究者们需要通过多种方法对细胞进行诱导和修饰。不同细胞对于诱导的反应也不相同，需要比较相同处理条件下各种细胞的变化及处理后的特点。

本实验选用能够促进细胞分泌胶原蛋白，向韧带方向分化的TGF-β1[16-17]，和有较强的促进细胞增殖的能力的bFGF-1[18-20]。应用2种生长因子诱导细胞提高细胞活性和细胞外基质合成。在细胞活性和增殖能力比较，诱导后2种细胞的增殖能力均提高，以rBMSCs提高明显，第9天时提高了21.9%。比诱导后的rLFs高11.1%。在韧带特意性蛋白分泌比较，诱导后rBMSCs总胶原蛋白量提高了41.1%，rLFs只提高了6.2%比rBMSCs高19.4%。诱导后rBMSCs细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白提高了14.7%和7.1%，rLFs分别提高了3.9%和5.7%。rLFs的Ⅲ型胶原蛋白量提高明显，rBMSCs出现Ⅰ胶原蛋白提高程度明显高于Ⅲ型胶原蛋白，而在韧带构建中Ⅲ型胶原蛋白起到了促进胶原及细胞网络化，产生抗张力结构的作用。诱导后韧带相关基因Tenascin-C、MMP-2、Fibronectin均提高，虽然rLFs的mRNA提高幅度没有rBMSCs高，但是其mRNA浓度均高于rBMSCs。

生长因子处理下rBMSCs对于的反应更明显，两种细胞韧带特异性蛋白均得到了提高，rBMSCs提高较rLFs明显，但其总胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白量的量仍低于rLFs，Tenascin-C、MMP-2、Fibronectin的mRNA浓度也低于rLFs。显示了rLFs作为成熟体细胞的优势，也提示rBMSCs的易于诱导的特性。

通过比较2种细胞，为其今后在韧带组织工程学应用提供了一些数据基础， rBMSCs的高活性和易被诱导的特点，可以相应的应用于对细胞要求较高的支架或韧带培养环境中，rLFs对于韧带特异性蛋白的合成能力使其可以应用于对韧带特异性蛋白要求较高的环境中。

针对细胞不同的特性也可以选用不同的带生长因子的支架材料，根据实验结果我们在应用生长因子处理细胞是应根据细胞特性进行诱导，如针对性不强则达不到预期效果。对于BMSCs应主要进行韧带特异性的分化诱导，而LFs则在细胞活性和增殖方面进行调节。随着基因工程的发展，针对2种细胞不同的特性进行基因修饰或调整，也可大幅度的改变细胞特性，使细胞更好的应用于韧带组织工程学。

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[收稿2014-06-03;修回2014-11-02]

(编辑：王福军)

Comparison of rat BMSCs and LFs as cell source for ligaments tissue engineering

ZhangChenghao,JinYing,FanQinghong,SunPengpeng,WuShuhong,LiuYi

(Department of Orthopedics,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To compare cellular activities, proliferation and extracellular matrix synthesis between rat bone mesenehymal stem cells (rBMSCs) and fibroblasts (rLFs) as cell source for ligament tissue engineering.Methods rBMSCs were isolated and separated by explants method. rLFs were isolated and separated by digestion method. Primary cell activities and proliferation were observed by inverted microscope. The third generation cells with and without the application of TGF-β1and bFGF-1 were divided into the induced and the non-induced groups. After 12-day culture, cells activities and proliferation were observed by MTT assay. Intracellular and extracellular collagen type Ⅰand type Ⅲ concentration were determined by ELISA. Quantification of collagen and total extracellular matrix proteins were analyzed by selective binding of Sirius Red and Fast Green FCF. The mRNA expressions of Fibronectin, Tenasein-C and MPP-2 were analyzed by real-time RT-PCR.Results rBMSCs had much higher activities and proliferation ability than rLFs at prime generation. The third generation cell activity in non-induced rBMSCs group and induced rBMSCs group was higher than that in non-induced rLFs group and induced rLFs group, respectively, in which the cell activity in the induced group was higher than that in the non-induced group. The total collagen in the induced and non-induced rLFs group was more than that in the induced and non-induced rBMSCs group. The density of collagen type Ⅰ and type Ⅲin rBMSCs group induced by growth factor was increased faster than that in induced rLFs group, where the density of collagen type Ⅰin rBMSCs group was increased higher than that of collagen type Ⅲ and the density of collagen type Ⅰ and type Ⅲ in rLFs group was increased proportionally. Ligament-related gene mRNA expressions in rBMSCs group were increased faster than that in rLFs group, while the level of gene mRNA expressions in rBMSCs group was lower than that in rLFs group.Conclusion As the cell source of ligament tissue engineering, rBMSC has higher cellular activities and proliferation ability and better reaction to the induction than rLFs and rLFs has a better ligament character and higher ligament-related gene expressions than rBMSC.

BMSC; LF; growth factor; ligament; tissue engineering

贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合SY字[2010]2091)。

刘毅，男，教授，硕士生导师，研究方向：韧带组织工程学与运动医学，E-mail:13308529536@163.com。

R686.5

A

1000-2715(2015)01-0054-06