大鼠羊水栓塞动物模型制备方法的改进

杨 阳，沈 鑫，余 舰

(1.遵义医学院 法医学系，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 司法医学鉴定中心，贵州 遵义 563099)

技术与方法

大鼠羊水栓塞动物模型制备方法的改进

杨 阳1，沈 鑫1，余 舰2

(1.遵义医学院 法医学系，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 司法医学鉴定中心，贵州 遵义 563099)

目的 改进大鼠羊水栓塞动物模型的制备方法。方法 将30只晚孕SD大鼠随机分为对照组(NS组)、羊水原液组(AF组)、羊水胎粪液组(MAF组)。用改良的方法建立羊水栓塞模型，观察大鼠呼吸、心率改变，取肺组织进行HE染色、APM特殊染色和CK16免疫组织化学检查。结果 AF组和MAF组肺组织特殊染色及免疫组化检查均有阳性发现，NS组未见。结论 改良后的方法操作简易、成功率高,是较为理想的建模方法。

羊水栓塞；动物模型；APM；CK16

羊水栓塞(Amniotic Fluid Embolism，AFE)是产科最严重的并发症之一，其发病罕见、死亡率高，确切的发病机制尚未清楚。制备动物模型模拟人类AFE发病可为临床早期诊断、提前干预提供实验依据。本实验在既往大鼠AFE模型制备方法的基础上进行改进，力图摸索出更接近人体且简易的建模方法。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性SD孕鼠30只，胎龄20 d，体重280～400 g，由遵义医学院动物实验中心提供。根据注入液体的性质不同随机分为3组：对照组(NS组)10只、羊水原液组(AF组)10只、羊水胎粪液组(MAF组)10只。Alcian blue 8GX(生工生物工程股份有限公司)，phloxine B(上海晶纯生化科技股份有限公司)，Martius yellow(东京化成工业)，兔抗鼠细胞角蛋白16(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 手术操作 术前12 h禁食，自由饮水。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔麻醉，麻醉生效后眼眶取血1 mL(见图1A)。将孕鼠固定于手术台，备皮，取下腹正中切口3 cm，行子宫次全切除术，分离下腔静脉和腹主动脉备用(见图1B)。

1.3 羊水收集 将切下的子宫轻轻置于湿纱布上，切勿用力牵拉，避免子宫静脉破裂，导致血混入羊水中。一手托住子宫，一手持注射器针头在无血管纹路处轻轻划破子宫壁和胎膜，让羊水顺势流入收集管内(见图1C)。若羊水粘稠可换用大号注射器抽吸。

1.4 制备羊水胎粪液 取出胎鼠，剪开腹壁，轻轻挤压出胎肠，用1 mL注射器抽吸羊水后注入肠腔内将胎粪冲洗至收集管中(见图1D)，用微量加样器配置1%羊水胎粪液。

1.5 制备栓塞模型 以0.25 mL/100 g剂量从大鼠下腔静脉分别注入相应液体：NS组(生理盐水)、AF组(羊水原液)、MAF组(1%羊水胎粪液)(见图1E)。注入后纱布按压止血，观察60 min后用5 mL注射器经腹主动脉取血3 mL(见图1F)。若观察期间大鼠死亡，可立即经腹主动脉取血。10%KCL处死大鼠，取肺组织固定于10%甲醛溶液中。

A:眼眶取血；B：分离下腔静脉(1)、腹主动脉(2)；C：取羊水；D：取胎粪；E：下腔静脉注入实验液体；F：腹主动脉取血。

2 检测指标

监测大鼠在观察期间呼吸、心率的改变。肺组织进行HE染色、阿尔辛蓝-荧光桃红-马休黄特殊染色(APM)和细胞角蛋白(CK16)免疫组织化学检查，验证模型是否成功。

3 结果

3.1 临床表现及取材 AF组与MAF组注入实验液体后呼吸频率逐渐降低，幅度变浅；心率先加快后减慢。3组大鼠均成功收集到血液、羊水及胎粪液。

3.2 HE染色 AF组与MAF组大鼠肺间质明显增宽，均有不同程度充血、水肿，伴炎性细胞浸润，部分肺小血管可见到淡染的不定形物质，NS组未见(见图2)。

A：NS组；B：AF组；C：MAF组。

3.3 APM染色 AF组与MAF组肺小血管中的不定形物质(羊水黏液)被染成蓝色，角化鳞状上皮染成桃红色，NS组未见(见图3)。

A:AF组；B:MAF组。

3.4 CK16免疫组织化学染色 AF组与MAF组肺小血管中可见染成棕黄色，颗粒状或丝状的鳞状上皮，NS组未见(见图4)。

A:AF组；B:MAF组。

4 讨论

在AFE的研究中学者们尝试用不同物种及不同条件制作模型，早期的研究是将人类羊水注入未孕的雌性动物体内[1]，其中部分动物出现AFE症状，部分动物没有类似表现。考虑到存在种属间差异性，后期建模多选用晚期妊娠的动物并且注入它们自身的羊水，不但提高了模型的成功率，也增加了实验结果的说服力。近年来动物模型多选用兔和大鼠，其中啮齿类动物与人类遗传物质有90%以上的同源性，且大鼠繁殖率高，可重复性好，是AFE较为合理的模型选择。

尽管多数实验都使用大鼠建立AFE动物模型，但暂无完整的文献报道。本课题组在历年AFE发病机制的研究中发现，既往报道的建模方法存在不足之处，实践操作较为复杂且动物死亡率高。经不断摸索，对传统的建模方法进行以下改进。

4.1 术前取血 报道中为监测外周血液动力学变化，多行颈总动脉插管术，后经动脉导管取血[2]。该项操作为防止导管内血液凝固通常需提前将导管肝素化，而肝素化的血液可影响实验结果。我们发现，实验前选择眼眶取血效果更好，眼球血运丰富，取血后按压可迅速止血且创伤小。

4.2 配制羊水胎粪液 既往的方法多为取出胎鼠直肠，轻轻挤压出胎粪或是直接碾磨肠管组织[3]。该项操作的可行性不高，经过测量，胎鼠肠管直径为0.05～0.10 cm，质脆，挤压易断裂，所以用挤压的方法收集胎粪是不合理的。碾磨法，即使将碾磨液高速离心取上清液，液体的成分也与胎粪相差甚远。本实验使用1 mL注射器抽取羊水直接注入肠腔，可将胎粪冲洗出来。当羊水粘稠时，可用生理盐水替代。通常一只胎鼠可取出10～20 μL胎粪。配置1%羊水胎粪液(原始文献未详)改用微量加样器对羊水和胎粪进行等比例混合，比以往将胎粪干燥后称重再与羊水混合更加精确、省时。

4.3 注入实验液体 报道中通常是经股静脉和尾静脉注入羊水及羊水胎粪液[4-5]，经改良我们选取下腔静脉。首先，可利用腹部同一切口，避免再次切开分离，减少损伤、缩短手术操作时间。其次，AFE发生时，羊水通过开放的静脉窦进入子宫，经髂静脉汇入下腔静脉，最后到达右心房进入肺循环。下腔静脉注入羊水可高度模仿人体羊水进入机体的循环通路。最后，下腔静脉是体内最大的静脉，操作较方便，成功率高。

4.4 术后取血 报道中多通过颈动脉导管取血或是大动脉离断取血[2]。我们在实验中发现，一些大鼠在注入羊水过程中或注入羊水后可突发呼吸、循环衰竭，外周血管快速坍塌，及时的心外按压也很难抢救成功。经过验证，颈动脉导管取血法在大鼠突发死亡时成功取血率较低，立刻心脏穿刺取血得到的血量也很少。在我们既往实验中对突发死亡的大鼠采用心脏取血，取血量为0.5～1.0 mL。大动脉离断取血受外界影响较大，也不可取。改进后我们选取与下腔静脉伴行的腹主动脉，可在分离下腔静脉时同时分离出腹主动脉，该动脉较大，取血方便，甚至可在大鼠突发死亡时迅速取血。实验中对建模成功的大鼠通常可按要求取到3mL以上血液，突发死亡的大鼠及时取血也能取到2 mL，明显提高取血的成功率。

AFE最常见的临床表现是突发的急性肺损伤、低血压、心脏骤停和DIC等，实验中大鼠注入羊水及羊水胎粪液后可出现不同程度的心肺衰竭症状，与临床相符。

随着免疫学技术的发展，学者们发现多种免疫学因子与AFE密切相关，如STN抗原、补体C3、白三烯及白细胞介素等。但这些发现尚存在局限性，未能解释AFE发生发展的全部过程，仅限于实验研究阶段。目前法医学AFE的诊断主要依靠尸检肺组织病理学检查，在肺小血管中找到胎儿有形物质。考虑到HE染色缺乏特异性，不能明确组织的来源。国内学者[6]用ÅPM对AFE病例进行染色，阿尔辛蓝能将羊水中嗜酸性的黏液成分染成蓝色，荧光桃红可将角化的鳞状上皮染成桃红色，马休黄用于分色及增色，使视野更加清晰、鲜明。Wang等人[7]同时对AFE及羊水吸入综合征(amnioticuid aspiration ，AFA)死亡病例进行肺组织APM染色，分别在AFE患者的肺小血管及AFA患儿支气管中发现染成同样颜色的羊水成分。且APM染色对少量羊水入血的病例也有较高的敏感性，可用于法医学中疑似AFE病例的诊断，减少漏诊及误诊率。

CK16表达于角化和增生的鳞状上皮内，肛管、足底、舌和食道常见，而羊水中的角化鳞状上皮大多来源于胎儿皮肤的表层上皮[9]。于家华[9]在研究中发现AFE死亡患者肺组织与正常人体皮肤中CK16均有阳性表达，推测该鳞状上皮来源于表层皮肤。赵敏等人[10]研究不同剂量羊水进入大鼠体内后CK16的表达变化，观察到随着羊水入血量的增加，肺CK16阳性表达明显增加，且染色更深。认为CK16可作为AFE客观的诊断指标。因此我们联合APM染色和CK16免疫组织化学检查可以综合性的鉴别肺血管中的物质是否来源于羊水，由此验证动物模型是否建立成功。

实验结果表明，改进后的建模方法具有损伤小，操作简单、重复性好、成功率高等优点，是一种值得推广的大鼠AFE模型制备方法。

[1] Steven L, Clark M D. Amniotic Fluid Embolism[J]. Obstetrics & Gynecology,2014,123(2):337-348.

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[收稿2014-11-24;修回2014-12-28]

(编辑：王福军)

Technique improvement on animal model of amniotic fluid embolism in rats

YangYang1，ShenXin1，YuJian2

(1.Department of Forensic Pathology,Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China；2.The Forensic Medicine Center of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To improve the preparation method of animal model of amniotic fluid embolism in rats. Methods 30 late pregnancy SD rats were randomly divided into control group (NS), amniotic fluid group (AF) and the mixture of amniotic fluid meconium group (MAF). Modified methods was used to form amniotic fluid embolism model; to observe the breath and heart rate of rats; lung tissues were collected for HE staining, APM staining and CK16 immunohistochemistry. Results The HE staining, APM staining and CK16 immunohistochemistry study revealed positive in the lung tissues of both AF group and MAF group, but did not show in NS group. Conclusion The modified method was easier to operate and with high success rate, it is an ideal modeling method for amniotic fluid embolism in rats.

amniotic fluid embolism; animal model;APM;CK16

贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J字[2012]2358)。

余舰，男，教授，硕士生导师，研究方向：羊水栓塞发病机制，E-mail:783065265@qq.com。

R714.46

A

1000-2715(2015)01-0097-04