人胃癌HGC-27裸鼠皮下移植瘤模型的建立

靳俊峰,欧小波,阮 媛,郭瑞珍

(遵义医学院珠海校区 病理学教研室， 广东 珠海 519041 )

基础医学研究

人胃癌HGC-27裸鼠皮下移植瘤模型的建立

靳俊峰,欧小波,阮 媛,郭瑞珍

(遵义医学院珠海校区 病理学教研室， 广东 珠海 519041 )

目的 建立人胃癌细胞株HGC-27裸小鼠皮下移植瘤模型，为胃癌的研究提供简单实用的载体。方法 培养HGC-27人胃癌细胞，达106～107个活细胞/瓶，以0.9%氯化钠无菌水溶液为溶剂制成单细胞悬液，随机注射到裸小鼠左腋下或右腋下，观察肿块的形成，并进行组织学观察。结果 注射后8 d触及米粒般大小的肿块，14 d可见肿块明显隆起。组织学观察癌细胞无腺体样结构形成，呈片状、巢状或条索状排列，细胞形状不规则，呈圆形、梭形或不规则形，核大深染，核质比增高，可见核分裂象。结论 人胃癌细胞株HGC-27裸小鼠皮下移植瘤模型的建立，操作简便，肿块表浅，可直接观测肿瘤，为进一步的研究能提供简单有效的模型。

胃癌；裸鼠；细胞株；移植瘤模型

胃癌是危害我国居民身体健康的常见消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率居于所有恶性肿瘤的前列[1]。由于人的胃癌标本相对难以获得，受时间、空间、社会、伦理等诸多因素的限制，故动物实验就成为研究胃癌的重要手段之一。通过动物实验可以方便地获得大量实验材料，从而为下一步的实验提供有效的研究载体。胃癌动物模型的建立就成为开展研究的先决条件，目前，胃癌动物模型的建立方法主要有诱导致瘤法和移植瘤法[2]，

其中皮下诱导致瘤法操作相对简便，因此本实验以裸小鼠的皮下诱导致瘤模型的建立为研究对象，为胃癌的基础和临床研究提供可靠实用的动物模型制作方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌细胞株 HGC-27人胃癌细胞,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 实验动物 BALB/c-nu/nu裸小鼠:购自北京华阜康生物科技股份有限公司,生产许可证号SCXK(京)2014-0004。雄性4～5周龄,体重16～18g。实验过程均在SPF屏障环境内饲养。实验前1周购入小鼠,使之适应新环境。

1.1.3 试剂 RPMI-1640培养基购自Gibco公司,胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌细胞HGC-27(见图1)转移至含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液中,在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,待细胞铺满培养瓶底后,用0.25%胰蛋白酶消化液消化成单个细胞,继续传代。经数代培养后，整个细胞铺满瓶底，采用细胞计数板计数，取生长期细胞数在106～107个活细胞进行实验。

1.2.2 制备单细胞悬液 在超净工作台内按照无菌操作规则进行，用0.25%胰蛋白酶进行消化，轻轻振荡摇晃，在显微镜下观察大多数细胞由长梭形变为圆形时，加入含血培养液，终止消化。吸管轻轻吹打整个瓶底，收集细胞，转移到离心管中，1 000转/min，离心5 min。弃上清，加入0.9%氯化钠无菌水溶液0.3 mL,重新悬浮，并移入eppendorf管中，密封置于冰盒备用。

1.2.3 皮下移植瘤模型建立 在超净工作台中按照无菌操作规则进行，无菌注射器(1.0 mL)抽出eppendorf管中的单细胞悬液，随机将裸鼠的左腋下或右腋下皮肤用碘酒、酒精局部消毒，提起皮肤，扎入皮下，有落空感时，即进入皮下组织。轻轻刺入深部，使整个针头进入皮下，注入液体，完毕后旋转针筒退出，轻轻按压，防止液体渗出。饲养，观察并测量肿瘤形成情况，整个环节均在 SPF 屏障环境内进行。

1.2.4 大体观察和组织学观察 定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、左腋下和右腋下体征。至第8周脱颈处死解剖,取原位瘤。所取标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色, 光镜下观察瘤体组织结构。

2 结果

左腋下或右腋下注射HGC-27胃癌细胞株后，裸小鼠生存状态良好，活跃，局部组织无明显炎症反应和全身不良反应。注射后第8天，可于左腋下或右腋下触及约米粒般大小之硬质肿块，14 d观察到左腋下或右腋下有一肿块局部隆起(见图2、图3)，与局部组织有粘连，不易推动，瘤体大小不等，表面凸凹不平。随着肿瘤的逐渐增大，动物明显消瘦，活跃度下降。将裸鼠脱颈处死后，将肿块取下，发现肿块与上肢及胸部组织粘连紧密，不易剥离，呈灰白色，表面有出血，沿最大径切开，中央有灰黑色的坏死区(见图4)。组织学观察可见胃癌细胞无腺体样结构形成，呈片状、巢状或条索状排列，细胞形状不规则，呈圆形、椭圆形或不规则形，核大深染，核质比增高，可见核分裂象及病理性核分裂象(见图5、图6)。操作的过程中，如果有液体的渗出，则长出的肿瘤体积较小，出现时间较晚。

3 讨论

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其机制尚未明确[3]。胃癌的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的复杂过程[4]，其发病率和死亡率居于恶性肿瘤的前列，严重危害我国居民的身体健康。因此,建立能够真实模拟临床胃癌的理想动物模型，对于深入研究胃癌的发生发展及寻找新的治疗方法具有重要的意义。

人胃癌裸鼠移植模型经历了细胞悬液皮下接种、细胞悬液胃壁处接种及完整组织块胃壁内移植3个代表性阶段。其中肿瘤细胞悬液注射裸鼠胃壁形成的原位移植模型最易发生类似人类肿瘤的转移过程[5],但实验研究发现皮下移植块原位移植法局部成瘤率和转移发生率较细胞悬液原位种植高,生长较细胞悬液原位种植法快2～3周[6]。原位移植成功率、转移率、荷瘤鼠中位生存期等指标均很高,能更好的模拟临床胃癌病人疾病的发生、发展过程[7-8]。然而肿瘤细胞悬液皮下接种法，操作简单，方便易行，形成的肿块位置表浅，可直接观测到肿瘤的生长，在一定的条件下也能够满足研究之所需。

本实验发现胃癌裸鼠模型的成功建立可能与以下因素有关：①注射的细胞量：注射到裸鼠皮下的胃癌细胞数量最少应达106～107个活细胞[9]，当细胞长满培养瓶底时，可用细胞计数板进行计数，通过多次观察发现，25cm2规格的培养瓶，长满细胞时即可达到该要求，细胞数目过多，造成浪费，过少则肿瘤不会生长；②裸鼠的选择：肿瘤的不同造成适宜的动物模型亦不同，如果没有特殊要求，一般选择BALB/c-nu/nu裸小鼠作为造模动物，鼠龄4～5周[10]，体重18～22g,对肿瘤细胞的耐受和免疫反应均较好;裸鼠性别一般选择同种性别，即雄性裸鼠或者雌性裸鼠，不宜同时采用雌雄裸鼠，可能引起混笼，形成孕鼠，影响实验；③注射部位的选择：常见的皮下注射部位为左腋下或右腋下，由于该处部位隐蔽，小鼠不易啃食或抓挠；也可以选择颈部下方和双肩部上方的部位，但是由于离颈部较近，当肿瘤巨大时可能会压迫气管，影响呼吸；④单细胞重悬液的选择：离心后将离心管上方的培养液弃去，管底的细胞一般选用0.9%氯化钠无菌水溶液重悬，如用细胞培养液易引起排斥反应，且重悬后液体的体积最好在0.3mL左右，过多可从针孔流出；⑤操作方法的影响：注射部位用酒精碘酒局部消毒后，戴无菌手套的左手轻轻提起皮肤，右手的皮试注射器(1 mL)垂直于皮肤刺入,落空感时，即进入皮下组织，向深部进针，至腋下后缓缓推出针筒，并慢慢旋转退出，完全退出皮肤后，轻轻按压针孔，防止液体流出；⑥单细胞重悬液的保存：一次皮下注射的裸鼠数量较多时，制备单细胞悬液耗费时间较长，须把eppendorf管插入冰盒保存，防止细胞死亡。

总之，皮下注射的方法及注射量等多种因素都会影响肿块的形成，从而决定胃癌裸鼠模型建立的成功与否。比如注射方法不正确，会引发液体地渗出，导致皮下注射细胞量不足，进而影响成瘤的速度和瘤块的大小，即注射有渗出时，成瘤速度慢肿块小，反之，则成瘤速度快而肿块大。肿块的大小、生长速度等受多种因素的影响，与裸鼠个体差异、注射细胞量、测量方法、时间等密切相关，重复性较差。

当然，肿瘤细胞悬液的皮下接种法与真实的临床胃癌还有一定的差异，但是可从某种程度上部分模拟胃癌，具有一定的应用价值。细胞悬液胃壁处接种法和完整组织块胃壁内移植法，从理论上讲，具有更好的相似生长微环境，能够更好的反映胃癌的生物学特性，但是操作复杂，要求较高。根据不同的研究目的，可选用不同的胃癌模型建立方法。

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[4] 杨卫军, 杨霞, 吴正阳, 等. Carbonic Anhydrase IX在胃癌中的表达及对胃癌术后复发的影响[J].遵义医学院学报, 2013, 36(5): 456- 459.

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[9] 贺岩, 李莹杰, 王齐敏, 等. 建立胃癌实验动物模型方法的研究[J]. 中国实验动物学报，2006, 14(4): 251- 254.

[10] 郝淑兰, 刘丽坤, 王晞星, 等. 人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测[J].世界中西医结合杂志, 2013, 8(4): 358- 360.

[收稿2014-10-09;修回2014-12-10]

(编辑：谭秀荣)

Establishment of a xenograft model in nude mice with human gastric cancer HGC-27 cells

JinJunfeng,OuXiaobo,RuanYuan,GuoRuizhen

(Department of Pathology, Zunyi Medical University Zhuhai Campus,Zhuhai Guangdong 519041,China)

Objective To establish a subcutaneous tumor xenograft model in nude mice by injection of human gastric carcinoma HGC-27 cells and to provide references to related researches.Methods HGC-27 cell line was cultured and made into single-cell suspension of 106～107in normal saline . HGC-27 cells were injected subcutaneously into nude mice. The oncogenesis was observed and the organization structure was observed through light microscope.Results The tumors were not observed till the 8th day of injection, but solid granule-like mass could be felt. The oncogenesis was evident at the 2nd week. Under the light microscope, the morphology of HGC-27 transplanted tumors show the characteristic of cancer.Conclusion The transplanted tumor model of HGC-27 cell in nude mice is established successfully.It provides a foundation for the experimental studies of gastric carcinoma.

gastric carcinoma;nude mice; HGC 27 cell line; xenograft model

贵州省卫生厅科学技术基金资助项目(NO：gzwkj2010-1-015);遵义医学院硕士启动项目(NO:F-355)。

R735.2

A

1000-2715(2015)01-0029-03