双黄连粉针中间体与制剂UPLC－MS指纹图谱相关性

石 朗，顾媛媛，焦丁宁，苏德龙，王英昕，董培良，陈大忠

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨150040;3.哈药集团中药二厂，哈尔滨150078)

注射用双黄连粉针由金银花、黄芩、连翘三味中药组成，经提取、精制、喷雾干燥(或冷冻干燥)，无菌分装制成，具有抗菌、抗病毒、消炎及增强免疫的作用，经药理学研究表明，它对流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒Ⅲ型等具有较广谱的抗病毒作用.临床上主要用于治疗急性上呼吸道感染、急性支气管炎、扁桃体炎、肺炎及小儿病毒性肺炎等[1].在实际生产中，为了提高制剂质量，保证成品合格率，在生产注射用双黄连粉针剂的各个环节中都有严格的质量控制标准.但双黄连粉针剂中间体一直没有准确的判定标准.为此，本试验通过建立双黄连中间体的指纹图谱，考察其与成品制剂是否存在相关性，建立中药注射剂的标准化、规范化、产业化和国际化的科学技术平台，为快速实现中药制剂的现代化和国际化奠定坚实的技术基础.

中药及其复方化学成分复杂，中药指纹图谱技术能标示中药材特征的共有峰图谱，借以辨别真伪、评价原料药材、半成品及成品质量的均一性和稳定性[2].UPLC相对于HPLC色谱法具有更好的分离效率，峰容量及灵敏度，能大大缩短样品运行时间[3]，本实验前期建立了双黄连粉针的UPLC指纹图谱方法，为了考察双黄连粉针剂成品和中间体的相关性，本试验同样采用UPLC技术建立中间体的指纹图谱，为高效控制和科学评价双黄连粉针剂的质量提供了有力的数据支持和实验依据.

1 实验材料

1.1 仪器

美国Waters AqcuityTM UPLC液相色谱仪(四元梯度泵一在线真空脱气机一自动进样器一二极管阵列检测器一柱温箱);MassLynx V4.1工作站;美国Micromass Q－TOF microTM四极杆－飞行时间质谱)(电喷雾离子源－正、负离子扫描方法－Lockspray);JA2003精密电子天平(上海良平仪器厂生产);KQ5200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产).

1.2 试药与样品

对照品均购自中国药品生物制品检定所，连翘苷对照品(批号110821－201213，供含量测定用)，黄芩苷对照品(批号110715－201314，供含量测定用)，绿原酸对照品(批号110753－201314，供含量测定用)，双黄连粉针剂中间体由哈尔滨中药二厂生产和提供，批号为 1409405、1409406、1409407、1409408、1409409、1409410、1409411、1409413、1409414、1409416、1409417、1409418 和 1409419.乙腈为色谱纯(美国Fisher公司生产)，甲酸为色谱级(天津科密欧化学试剂有限公司生产)，水为屈臣氏蒸馏水.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ACQUITY UPLCTM BEH C18Column色谱柱(1.7 μm，2.1 × 50 mm，Waters Corp，Milford USA);流动相:乙腈－0.1%的甲酸水，梯度洗脱条件如表1所示，流速:0.3 mL/min;柱温:40℃;进样量:3 μL.

表1 梯度洗脱表

2.2 质谱条件

电喷雾电离源(ESI)，采用正离子扫描检测;干燥气温度:350℃;碰撞能:100 V;干燥器流速:11 L/min;毛细管电压:4 kV;雾化器压力276 kPa;扫描方式全扫描，质量扫描范围:m/z100～1500.

2.3 对照品溶液的制备

分别取黄芩苷、连翘苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液分别制成每1 mL含黄芩苷0.1 mg、连翘苷60 μg、绿原酸40 μg 的混合对照品溶液.

2.4 供试品溶液的制备

从每批次样品中随机取本品5支的内容物，混匀，取本品1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液15 mL，超声处理10 min，并稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜即得.

2.5 方法学考察

2.5.1 运行时间

参照双黄连粉针剂的运行时间，故该中间体在与双黄连粉针剂相同的色谱条件下采集时间确定为22 min.

2.5.2 精密度试验

取批号为1409405的双黄连粉针剂中间体样品，按2.4项下的方法制成6份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，检测特征指纹图谱，记录色谱图，各共有色谱峰对参比峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3.0%，结果表明所用仪器精密度良好[4].

2.5.3 重复性试验

取批号为1409405的双黄连粉针剂中间体样品，按2.4项下的方法制成6份供试品溶液，照上述色谱条件进样，记录色谱图.各共有色谱峰对参比峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3.0%，结果表明该实验重复性良好.

2.5.4 样品稳定性考察

取供试品，分别于 0、2、4、6、8、12、24 h 测定，检测特征指纹图谱，记录.各共有色谱峰对参比峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3.0%，结果表明该样品24 h内具有良好的稳定性.

2.6 样品测定

将13批双黄连粉针剂中间体样品，照2.3项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件依次进样3 μL检测，记录对照品溶液和供试品溶液UPLC色谱图，分别见图1、2.将双黄连粉针剂批号1409405同样制成供试品溶液，进样3 μL，记录UPLC色谱图，见图3.

图1 对照品溶液的UPLC色谱图

图2 双黄连中间体指纹图谱标号图

图3 双黄连粉针指纹图谱标号图

2.7 指纹图谱共有模式的建立与评价

2.7.1 共有峰的确定

通过对13批样品的指纹图谱进行分析，20 min 内有26 个共有峰，分别为 1、3、4、8、12、13、14、17、18、20、21、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、39、40、42 号色谱峰，各共有峰的相对峰面积及相对保留时间均具有较好的重复性，其RSD均小于0.5%.通过与对照品的色谱图进行比对，确定了三个特征峰，4号峰为绿原酸，29号峰为黄芩苷，31号峰为连翘苷.

2.7.2 参比峰的选择

在各批次样品图谱中绿原酸的色谱峰(4号峰)分离度良好，峰面积积分值适中，且为所有样品共有，所以确定绿原酸为参照色谱峰.

2.7.3 相似度评价

将13批双黄连粉针中间体的图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版相似度软件，进行相似度的评价，结果见表2.结果表明，13批中间体样品相似度均大于0.9，说明其相似度较好，工艺比较稳定.

表2 13批注射用双黄连(冻干)指纹图谱的相似度

2.8 相关性测定结果

从测定结果可以看出，中间体的色谱图中共有42个色谱峰，而粉针剂成品中仅有30个色谱峰，但所指认的特征峰均可在双黄连中间体和粉针剂成品色谱图中追踪得到，中间体、成品制剂中4号峰均为绿原酸，中间体中29号峰与粉针成品中的22号峰均为黄芩苷，中间体中31号峰与粉针成品中的24号峰均为连翘苷，由此可见，双黄连中间体和粉针剂成品具有良好的相关性.

3 讨论

本研究通过建立13个批次双黄连冻干粉中间体的UPLC指纹图谱，对其中多个组分进行了研究，不限定域值，共有42个色谱峰.测定结果显示，整体分离效果较好，同时根据对照品对3个特征色谱峰的归属进行了定性分析，13批中间体的供试色谱图中有26个共有峰，相似度大于0.9，说明各批次间工艺较稳定，具有良好的一致性，该方法可以用于双黄连粉针中间体的质量控制.

将同一批次的双黄连粉针中间体与其成品制剂的色谱谱进行比较，发现成品制剂的色谱峰数目减少了(中间体42个色谱峰，成品30个色谱峰)，所指认的三个特征峰在双黄连中间体和粉针剂成品色谱图中追踪得到，可用于其质量评价指标，同时说明中间体和成品制剂之间具有相关性.对于减少的化学成分是否有效，后期有待于继续对其进行化学结构确认和药效进行深入研究.本研究在前期建立了相同批次双黄连粉针的指纹图谱，其相似度水平略低于中间体的相似度，其原因是否在于工艺上的问题，有待于进一步研究与探讨，总之，该方法的建立对成品制剂的质控奠定了基础，且为中药注射剂的规范化、标准化、产业化和国际化提供了科学的技术平台[5].

[1]李 方，姜文红，刘丽娟，等.注射用双黄连(冻干)指纹图谱的建立及其在质量控制中的应用[J].中成药，2007，29(8):1196－1198.

[2]谭超元，王海波，王 东.钩藤饮片HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(1):63.

[3]ZHOU D，ZHANG X，XU Q，et al.UPLC/Q－TOFMS/MS as a powerful technique for rapid identification of polymethoxylated flavones in Fructus aurantii[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50(1):2－8.

[4]CHEN W K，LUO Y H，XIONG W.Sutdy on fingerprint chromatogram of Coyrdalis decumbens for injection[J].Chin J Pharm Anal，2008，28(3):434.

[5]国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)[J].中成药，2000，22(10):671－ 675.