固定化核苷磷酸化酶的制备及其性质研究

黄炯威，刘宁，劳伟明，周华润，刘桂祯

（1.开平牵牛生化制药有限公司，广东江门529339；2.厦门大学生命科学院，福建厦门361000）

固定化核苷磷酸化酶的制备及其性质研究

黄炯威1，刘宁2，劳伟明1，周华润1，刘桂祯1

（1.开平牵牛生化制药有限公司，广东江门529339；2.厦门大学生命科学院，福建厦门361000）

目的优化核苷磷酸化酶的固定化工艺，并对固定化酶的性质进行研究。方法通过正交试验优化核苷磷酸化酶（包括嘌呤和嘧啶核苷磷酸化酶）固定化条件，并进一步对固定化核苷磷酸化酶的最适pH、温度及其稳定性进行研究。结果固定化酶条件为pH=8.0，温度为25℃，蛋白载量为20 mg/g载体，固定化时间为6 h；固定化核苷磷酸化酶的最适pH=7.5，最适温度为40℃，固酶连续使用20批次酶活力无明显损失。结论固定化核苷磷酸化酶稳定可靠，适合应用于工业化生产。

核苷磷酸化酶；固定化；制备

核苷磷酸化酶可分为嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase，EC2，4，2，1）和嘧啶核苷磷酸化酶（PyNPase，EC2，4，2，2）［1-2］。此酶能可逆地催化核苷（或脱氧核苷）磷酸化反应，其反应式为［3］：Rib（或dRib）-碱基1+Pi→Rib（或dRib）-1-磷酸+碱基1，Rib（或dRib）-1-磷酸+碱基2→Rib（或dRib）-碱基2+Pi。利用核苷磷酸化酶已成功合成了阿糖腺苷（Ara2A），2′-脱氧腺苷（2′-Deoxyade-2-nosine，dAR）、三氮唑核苷（Ribavirin）、5-氟尿苷（5-FUR）等［4-5］。在工业生产应用中，与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高、酶可反复使用、产物纯度高、产物分离简单等优点，本研究中对嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的固定化条件进行了充分研究，并进一步研究了固定化核苷磷酸化酶（简称固定化酶）的最适pH、温度及稳定性。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

嘌呤核苷磷酸化酶液酶和嘧啶核苷磷酸化酶液酶［2］为开平牵牛生化制药有限公司自制；固酶载体GZ011为本公司实验室自选共价结合型载体；腺苷、胞苷及其他检测用试剂均为国产分析纯试剂。LC-15C型高效液相色谱仪（岛津仪器＜苏州＞有限公司）；TU-1901型分光光度计（北京普析通用仪器公司）；VE-180型电泳槽（上海天能公司）；Eumix-R30型搅拌机（上海弗鲁克公司）。

1.2 方法［5］

酶活力定义及测定：以腺苷和胞苷为底物，分别加入一定量的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶催化反应，准确计时，用高效液相色谱仪监测腺嘌呤和胞嘧啶的生成量，计算酶活力，其定义为每分钟单位酶量催化生成的腺嘌呤或胞嘧啶的微摩尔量。

蛋白检测：以牛血清白蛋白（BSA）配制标准蛋白溶液，按考马斯亮蓝法（Bradford法）制作标准曲线及检测样品蛋白含量。

酶固定化：嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶经提取纯化后，加入适当pH的缓冲液稀释，以及一定量的GZ011载体，在适当温度下搅拌固定化，固定化完成后过滤分离固定化酶与残酶液，固定化酶用pH缓冲液洗涤数次，取固定化酶样品进行酶活检测。

固定化酶性质研究：以腺苷和胞苷为底物，分别加入一定量的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶催化反应，改变反应液pH和温度，用高效液相色谱仪监测腺嘌呤和胞嘧啶的生成量，计算底物转化率，根据不同反应条件下的转化率找出固定化酶的最适pH和最适温度。取固酶样品连续投料反应多个批次，监测不同反应批次后的固酶的酶活力损失情况，分析固定化酶的稳定性。

2 结果

2.1 固定化方法优化

采用L9（34）正交试验方案，其中固定化温度选择15，20，30℃3个水平，固定化酶载体的蛋白载量为15，20，30 mg/g 3个水平，固定化pH条件选择了7.0，8.0，9.0 3个水平，固定化时间为4，6，8 h 3个水平，通过正交试验以较少的试验次数来优化固定化酶的条件，结果见表1。可见，4个考察因素中固定化pH对固定化酶酶活力影响最大，其次是蛋白载量，影响最小的是固定化时间，考虑到固定化温度越高，对固定化前液酶的稳定性越不利，最终确定了固定化酶的最佳条件，即固定化温度为25℃，固定化载体蛋白载量为20 mg/g，固定化pH=8.0，固定化时间为6 h。

2.2 固定化酶的最适pH

以催化合成阿糖腺苷试验研究固定化酶的性质，在含20 mmol/L阿糖尿苷、10 mmol/L腺嘌呤和50 mmol/L磷酸盐、不同pH的反应液中，加入一定量的固定化嘌呤核苷磷酸化酶和固定化嘧啶核苷磷酸化酶，35℃条件下搅拌反应8 h，反应完成后用高效液相色谱仪测定底物阿糖尿苷和生成的阿糖腺苷量，计算反应转化率。结果见图1。可见，在反应液pH为6.0～9.0范围内，pH为7.5时底物转化率最高。

表1 固定化嘌呤核苷磷酸化酶及固定化嘧啶核苷磷酸化酶正交试验结果

图1 不同反应pH的转化率

2.3 固定化酶的最适温度

在含20 mmol/L阿糖尿苷、10 mmol/L腺嘌呤、50 mmol/L磷酸盐和pH=7.5的反应液中，加入一定量的固定化嘌呤核苷磷酸化酶和固定化嘧啶核苷磷酸化酶，在不同温度条件下搅拌反应8 h，反应完成后用高效液相色谱仪测定底物阿糖尿苷和生成的阿糖腺苷量，计算反应转化率。结果见图2。可见，在试验温度范围内，温度越高，底物转化率越高，温度升到35℃以上后，转化率升高幅度变小。考虑到过高的反应温度可能会影响固定化酶的使用寿命，固定化酶的最佳使用温度暂定为40℃。

图2 不同反应温度的转化率

2.4 固定化酶的稳定性

在含20 mmol/L阿糖尿苷、10 mmol/L腺嘌呤、50 mmol/L磷酸盐和pH=7.5的反应液中，加入一定量的固定化嘌呤核苷磷酸化酶和固定化嘧啶核苷磷酸化酶，在40℃条件下搅拌反应8 h，反应完成后用高效液相色谱仪测定底物阿糖尿苷和生成的阿糖腺苷的量，计算反应转化率。结果见图3。可见，固定化酶的稳定性非常好，在连续使用20批次后酶活力依然无明显失活现象。

图3 连续多批反应转化率

3 讨论

利用核苷磷酸化酶合成核苷类药物应用前景非常好，而固定化酶催化技术在工业生产应用方面具有很大优势。本研究中采用了L9（34）正交试验方案对核苷磷酸化酶的固定化过程中的温度、蛋白载量、pH和固定化时间等条件进行了研究，结果显示，pH条件和固定化载体的蛋白载量对固定化酶的质量影响最明显，最佳固定化条件为：温度25℃，载体蛋白载量20 mg/g，pH=8.0，固定化时间6 h。结果显示，固定化酶蛋白载量并非越大越好，过大的蛋白载量不仅浪费液酶原料，还可能限制酶的活性中心与底物的结合。另外，在对固定化酶的性质和稳定性研究中发现，在pH为7.5～8.0、反应温度为40～50℃的条件下，固定化酶催化反应效果较理想，而在pH=7.5及40℃的反应条件下连续反应20批次后，各批次反应转化率波动不大，固定化酶未见失活现象。在以上研究条件下，固定化核苷磷酸化酶的性能和稳定性皆有良好表现，可达到产业化生产应用的要求。

［1］魏元刚，倪孟祥，葛亚文，等.来源于产气肠杆菌的嘧啶核苷磷酸化酶基因在大肠杆菌BL21中的表达［J］.药物生物技术，2007，14（2）：94-98.

［2］黄炯威，莫世艺，刘宁，等.基因工程菌发酵表达核苷磷酸化酶条件的优化［J］.中国药业，2014，23（7）：22-23.

［3］闫蓬勃，邱蔚然，丁庆豹.核苷磷酸化酶的产酶条件优化的研究［J］.药物生物技术，2001，8（2）：83-85.

［4］樊华伟，傅绍军，邵志宇，等.核苷类药物酶法合成研究进展［J］.生物技术通讯，2005，16（11）：690-692.

［5］周长林，邱蔚然，周利，等.用大肠杆菌游离细胞酶法合成核苷药物［J］.华东理工大学学报，1997，23（5）：535-539.

Preparation of Immobilized Nucleoside Phosphorylase and Research on Its Property

Huang Jiongwei1，Liu Ning2，Lao Weiming1，Zhou Huarun1，Liu Guizhen1
（1.Kaiping Genuine Biochemical Pharmaceutical Co.，Ltd，Jiangmen，Guangdong，China529339；2.Life Science Department，Xiamen University，Xiamen，FuJian，China361000）

ObjectiveTo optimize the immobilization process of the nucleoside phosphorylase and research on its property.Methods The immobilization process of the nucleoside phosphorylase（including purine and pyrimidine nucleoside phosphorylase）was optimized by orthogonal test，and took further study of the finest pH，temperature and stability of immobilized nucleoside phosphorylase.ResultsThe finest condition of immobilized enzyme was pH=8.0，25℃，20 mg/g protein loads and immobilize for 6 h；the finest condition for the immobilized nucleoside phosphorylase to catalyze was pH=7.5 and 40℃.There was no significant loss of activity of the enzyme after use for catalyzing 20 batches consecutively.ConclusionThe immobilized nucleoside phosphorylase is stable and reliable，which is suitable to application in industrial production

nucleoside phosphorylase；immobilized；preparation

IQ460.6；R977.6

A

1006-4931（2015）20-0032-03

黄炯威（1978-），男，工程师，研究方向为生化药物，（电话）0750-2882338（电子信箱）jmlgz@126.com。

2014-07-11；

2015-03-04）