超快速冷冻法在犬精子冷冻保存中的应用

于善一 钟友刚 施振声

目前，犬精子的传统慢速冷冻法虽已广泛应用，但仍存在诸多不足。超快速冷冻法可以实现精子玻璃化，有望进一步提高冷冻质量。研究分别以蔗糖浓度为0M、0.05M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M等渗溶液（约300mOsm/L）作为冷冻液，利用微粒法对犬精子进行超快速冷冻，并对复苏后精子的总活力、存活率、顶体完整性、畸形率进行评价。结果表明，0.125M蔗糖组的总活力为40.1±2.0%，存活率60.4±2.8%，顶体完整性65.6±10.5%，存在显著优势。超快速冷冻法能够消除传统方法中冷冻保护剂的毒性和污染，操作快捷、经济，但冷冻效果仍存在相当的提升空间，值得进一步研究与探讨。

一、概述

精子冷冻技术是犬繁殖项目中的重要技术。通过液氮对预处理后的精子进行超低温冷冻可以保存优良品种、提高繁殖效率、降低传染病风险。经典的犬精子冷冻技术需要添加甘油、卵黄或低密度脂蛋白等，作为精子的冷冻保护剂，同时应用价格昂贵的程序化冷冻仪进行“慢速”冷冻，全过程耗时3～4小时。另外，甘油作为一种渗透性冷冻保护剂的添加会直接引起细胞毒性，进而影响受孕率。而现在已有研究者利用超快速冷冻法进行人精子冷冻保存，并获得成功。该方法应用玻璃化冷冻的原理，最大程度减少细胞内外冰晶的形成，同时避免了甘油等渗透性冷冻保护剂的使用，高效、快速、成本低廉。本研究尝试将超快速冷冻法应用于犬精子冷冻保存，以求为今后犬繁殖相关科研、临床项目提供参考。

二、材料

（一）试验动物

选 用2～6 岁 公 犬4 头( 杂 种犬），饲喂全价日粮食。试验前均经过3～5 次训练，可以顺利进行人工按摩法采精且对操作耐受良好。同一犬采精间隔5 天或以上。精子活力大于80%的精液可作为试验样本。

（二）试验试剂

自配人输卵管液（human tubal fluid，HTF） 、蔗糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、吉姆萨染液、中性红、甲醛、盐酸。

（三）主要仪器

Olympus CX41 相 差 显 微 镜、Makler Counting Chamber 精子计数板、20 目筛等。

三、试验方法

（一）精液采集与预处理

人工按摩法采精后，对精子活力、密度、畸形率、存活率（低渗膨胀试验）、顶体完整性（吉姆萨染色）进行评价。同时以700g离心5min 后，弃上清并用HTF 重悬沉淀，调整精子重悬液密度为100x106/ml。室温下保存。

（二）冷冻液准备

将0.3M 蔗糖水溶液与HTF 以6 种不同比例混合作为冷冻液，并以20:1的比例加入预先处理的精液（终密度5x106/ml）后，使冷冻液中蔗糖的终浓度分别达到0M、0.05M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M。同时添加1%BSA。

（三）冷冻设备准备

将20 目筛放入泡沫箱中后注入液氮，使液面高3～5cm。静置5min 后备用。

（四）冷冻过程

方 法 依 照Isachenko（2008）。将配置好的精子悬液于液氮上方8cm 处悬置30s 后，用30μl 移液器以45°角滴入液氮中，使液滴形成小的固态颗粒。待颗粒沉入筛网中后，加入下一滴。用1.8ml 冷冻管收集颗粒，与液氮中保存24h 以上。

（五）解冻

将5个颗粒依次投入4ml 预热37℃的HTF（含1%BSA）中，轻轻摇晃8s 后，于37℃水浴3min。

（六）评估

对解冻后精子的总活力、存活率、顶体完整性、畸形率进行评价。使用吉姆萨染色法进行顶体完整性评价。具体评价方法参考WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen，5th ed。

（七）统计分析

使用SPSS 21 进行统计分析。使用单因素ANOVA 中的最小差异性显著法（Least Significant Difference，LSD）进行显著性分析，并以a（P<0.05）和b（P<0.01）表示。试验结果均以“平均值±均值标准误（Mean±SEM）”表示。试验重复3次。

四、结果

新鲜精液总活力83.8±3.2%，顶体完整性96.4±1.2%，存活率90.8±0.6%，畸形率16.4±5.6%。快速冷冻后评估结果如表1。冷冻后各组精子总活力、存活率、顶体完整性与新鲜精液相比均存在极显著差异（P<0.01），畸形率之间无差异（P>0.05）。

表1 不同蔗糖浓度对精子超快速冷冻效果的影响（%）

（一）总活力

以0M 组 为 对 照 组，0.1M、0.125M、0.15M、0.2M、0.25M 组 与之相比差异显著。另外，根据数据统计，0.125M 组与其他各组的精子总活力均存在显著差异（P<0.05）。

（二）存活率

以0M 组 为 对 照 组，0.125M、0.15M、0.2M、0.25M 组 与 之 存 在显著差异。另外，除0.15M 组、0.2M 组外，其他各组的精子存活率与0.125M 组相比存在显著差异（P<0.05）。

（三）顶体完整性

以0M 组为对照组，仅0.125M组的精子顶体完整性与之存在显著差异（P<0.05）。

（四）畸形率

各组之间的精子畸形率无显著差异（P>0.05）。

五、分析讨论

研究设置6 组渗透压相似（约300mOsm/L）的蔗糖-HTF 溶液并以此作为冷冻液，对微量精子（5x106/ml）进行超快速冷冻（方法参考自Sánchez）。试验选用总活力、顶体完整性、存活率、活力等基本精子评估指标，对冷冻效果进行评价和比较。将其中主要结果绘制为柱状图，见图1，其中Control 为0M 组，即无蔗糖组。如图所示，应用超快速冷冻方法进行犬精子冷冻时，各组复苏后精子均有一定的活力。但0.125M 组在精子总活力、存活率、顶体完整性方面均具有优势。2011年，Sánchez 等在犬精子超快速冷冻研究中设立了0.05M、0.125M、0.2M 三组浓度蔗糖并评价冷冻效果差异，结果表明0.125M 组具有明显优势，精子活力可达42.5 ± 2.3%。但是，该三组蔗糖设置对应的渗透压约为200mOsm/L、275mOsm/L、350mOsm/L。由于犬精子对渗透压的敏感性较高，因此在冷冻之前精子就可能由于高渗或低渗而受损进而丧失活力。因此，本试验设立等渗蔗糖梯度试验，即配制0.05M 至0.25M 等6 组蔗糖浓度的同时，保持各组渗透压的相似性。

图1 不同蔗糖浓度的冷冻效果差异对比

有研究者分别利用NaCl、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、乙二醇、DMSO 等物质提高溶液渗透压，针对犬精子的渗透压耐受性进行了评价。结果表明，添加NaCl 并引起的渗透压增高至500mOsm/L 时，犬精子活力或质膜完整性均降至约30%；高于700mOsm/L 时则几乎完全丧失活力。而不同的单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）使渗透压上升至500mOsm/L 时，精子质膜完整性仍保持约70%，但活力下降至约40%。这意味着高浓度的冷冻保护剂虽然理论上有助于精子冷冻效果，但本身具有的高渗透压可能使犬精子提前丧失活力。因此在冷冻液设计上需要加以平衡。

所谓“超快速冷冻法”是实现哺乳动物精子玻璃化冷冻的具体方法。“超快速”一词与传统冷冻的“慢速”相区别，其过程中无需平衡，亦无程序降温，而是直接将样本放入液氮或-160℃环境中。慢速冷冻的降温时间为2～3 小时，而超快速冷冻最低仅为5 秒。研究者通过不同的冷冻载体，以实现快速降温。如尝试使用5mm 直径的铜环、铝箔表面颗粒冷冻、开放式拉长细管、开放式细管、微滴法、Cell Sleeper 等对人类精子进行超快速冷冻。各种方法均以实现精子玻璃化为目的，但最终效果有所差异。Mazur 于1972年提出“双因子假说”认为，细胞在冷冻过程中要平衡渗透压变化与冰晶形成两大因素。但玻璃化观点的提出和实践在一定程度上跨越了双因子假说的讨论范围，以新的视角讨论冷冻保护与冷冻损伤。

“玻璃化”本是自然存在的一种物理过程，在严寒气候下生存多种昆虫或两栖类动物体内多存在这种现象。灯蛾毛虫在一年中有10个月冰冻在-50℃环境中却仍然可以生存。某些品种的青蛙体内65%水分冻结后，依然可以存活数日甚至数周。有些动物如北极蛙类可以通过分泌胰岛素刺激葡萄糖释放并进入细胞，同样可对机体形成保护。而甘油、葡萄糖蔗糖这类物质则被认为是一种“冷冻保护剂”，可以使动物的体液在低温时固化却不形成晶体——这便是玻璃化转变的过程。从热力学角度讲，随着温度降低，液体开始向固体转变，若该过程中液体的分子排布和热力学状态并不发生改变，则溶液会形成一种无冰晶的高粘滞“玻璃态”，这一过程被称为玻璃化。研究表明，玻璃态的形成与冷冻保护剂的浓度、降温速度、终温度相关，不论是渗透性冷冻保护剂还是非渗透性冷冻保护剂，其浓度越高，则玻璃化所需要的降温速度越慢。但是，精子无法耐受高浓度渗透性冷冻保护剂，因此可尝试通过高速降温和复温过程，以实现细胞内外溶液的玻璃化。这种思路已在实践中得到证实。

六、结语

研究以HTF、0.125M 蔗糖、1%BSA为配方作为犬精子超快速冷冻的冷冻液，获得了较好的保存效果。超快速冷冻方法以实现精子样本玻璃化为目的，能够消除传统方法中冷冻保护剂的毒性和污染，操作快捷、经济，但冷冻效果仍存在一定的提升空间，值得进一步研究与探讨。