法舒地尔对压力超负荷大鼠心脏的肌成纤维细胞表型分化的影响

赵凌杰 张蓓蓓 赵智明 张静 郭郡浩

心肌纤维化是诸多心血管疾病共同的病理改变，可引起慢性心力衰竭和恶性心律失常，其重要特征是肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）表型分化及持续活化[1]。Rho/ROCK信号通路广泛参与多种细胞功能，如细胞收缩、肌动蛋白骨架重组、黏附、迁移、增殖、分裂和基因表达等。大量研究表明，Rho/Rho激酶信号通路介导的肌动蛋白细胞骨架重组在MFB表型分化、收缩和迁移等行为中具有重要作用[2-3]，故阻断 Rho/Rho激酶信号通路是治疗心肌纤维化的重要目标[4]。我们前期的研究发现，Rho激酶非选择性抑制剂法舒地尔具有良好的抗心肌纤维化效果[5]。本实验拟进一步观察法舒地尔对压力超负荷大鼠心脏MFB分化的影响及机制，探究法舒地尔抑制心肌纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品及主要试剂

SPF级6周龄雄性SD大鼠50只，体重（180±20）g，由南京军区南京总医院动物实验中心提供[许可证号：SYXK（苏）2003-0032]。盐酸法舒地尔注射液（2 ml：30 mg）由天津红日药业股份有限公司惠赠，羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）测定试剂盒购自南京凯基生物技术发展有限公司，血管紧张素Ⅱ（angiotensionⅡ，AngⅡ）Elisa试剂盒购自上海雅吉生物公司，磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶蛋白亚基1（phosphorylated myosin phosphatase target subunit 1，p-MYPT1）一抗购自北京博奥森生物公司，α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和转化生长因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）一抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 心肌纤维化模型制备

大鼠适应性喂养5 d，造模手术前禁食12 h，自由饮水。给大鼠编号，按照随机数表法随机取8只为Sham组，42只为手术组。用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉。常规备皮消毒，于剑突下沿腹正中线逐层开腹，在肾动脉上方分离腹主动脉。手术组按照Anversa等[6]的方法用腹主动脉缩窄术制备压力超负荷诱导的心肌纤维化模型，在肾动脉上方0.5 cm用直径0.7 mm银夹夹闭，使腹主动脉缩窄60% ～70%，而 Sham组不予夹闭腹主动脉。确认无出血，关闭腹腔。术后禁食6 h，并给予青霉素10万U/kg肌注3 d预防感染。

1.3 分组及药物干预

术后4周末共有36只大鼠存活，手术组死亡14只，Sham组无死亡。将手术组大鼠按照随机数表法分为：Model组（10只）、FH 组（9只）和 FL组（9 只），分别经腹腔注射生理盐水 2 ml·kg-1·d-1、法舒地尔 30 mg·kg-1·d-1和法舒地尔10 mg·kg-1·d-1。Sham 组（8 只）经腹腔注射生理盐水2 ml·kg-1·d-1。术后8周末共有31只大鼠存活，手术组死亡5只（Model组3只、FH组和FL组各1只），死亡原因主要为严重心力衰竭。

1.4 标本采集及心肌病理形态分析

所有大鼠麻醉后打开胸腔，心脏穿刺收集血液5～10 ml以4 000 rpm离心10 min后取上清（血浆样品）。迅速剪取心脏，除去心房及右心室游离壁，仅保留左心室及室间隔。透壁剪取左室心尖部分组织投入液氮中，其余组织放于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h。常规取材、脱水、石蜡包埋，沿左室长轴线每隔1 mm横断面切取数张4 μm厚的切片，行HE和Masson染色。光镜下观察组织形态，采用Image-Pro Plus 6.0软件测定纤维化面积。以视野中所有蓝色胶原（Masson染色：胶原纤维呈蓝色，心肌细胞呈红色）面积之和（不包括血管周围胶原面积）除以心肌纤维和结缔组织面积总和，计算左心室间质胶原容积分数（collagen volume fraction，CⅤF）。以血管周围胶原面积除以血管面积，计算血管周围胶原容积分数（perivascular collagen volume fraction，PCⅤF）。

1.5 心肌HYP含量测定

准确称取60 mg液氮中心肌组织放入试管中，按照HYP试剂盒说明书以碱水解法提取蛋白，比色法检测样本吸光度，计算HYP含量。

1.6 酶联免疫吸附法检测心肌和血浆AngⅡ浓度

取冻存的心肌组织50～100 mg，研磨成匀浆，4 000rpm离心10 min，取上清。分别测定血浆和心肌样品中总蛋白的浓度。再按照Elisa试剂盒说明书，测定样品中AngⅡ的浓度。结果以测定蛋白浓度与总蛋白浓度的比值来表示。

1.7 免疫组化染色分析心肌 p-MYPT1、α-SMA、TGF-β1和OPN的表达

切片烘烤后，常规二甲苯脱蜡及乙醇梯度脱水，柠檬酸盐抗原修复缓冲液中进行抗原修复。灭活过氧化物酶，加入一抗孵育过夜，加入HRP标记二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水并封片。光镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况，细胞质中黄色为表达阳性，每张切片随机取5个视野拍照。用Image-Pro Plus 6.0测量这些区域的平均光密度（MOD），即阳性累积光密度除以照片面积。因为α-SMA还表达于血管平滑肌细胞，计算时选择血管平滑肌细胞外区域进行分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 法舒地尔对大鼠心肌病理形态的影响

图1（HE染色）和图2（Masson染色）显示了各组大鼠心肌病理学改变，与Sham组比较，Model组心肌纤维明显增粗且排列紊乱，间质和血管周围大量蓝色胶原沉积。与Model组比较，FH组心肌组织情况明显改善，接近Sham组，FL组心肌纤维增粗、紊乱，间质和血管周围胶原沉积，但较Model组减轻。

2.2 法舒地尔对大鼠心肌纤维化程度的影响

心肌HYP含量及Masson染色蓝色胶原的面积分数可反映心肌纤维化程度，其中CⅤF和PCⅤF可分别用于评估间质纤维化和血管周围纤维化程度。如表1所示，与Sham组比较，Model组心肌HYP含量、CⅤF及PCⅤF显著升高（P ＜0.01），心肌纤维化程度明显加重。与Model组比较，FH组和FL组心肌HYP含量、CⅤF及PCⅤF均不同程度的降低（P＜0.05或P＜0.01），心肌纤维化程度均有所减轻。

图1 各组大鼠心肌病理学改变HE染色（×400）

图2 各组大鼠心肌病理学改变Masson染色（×200）

表1 各组大鼠心肌HYP含量、CⅤF和PCⅤF比较（）

表1 各组大鼠心肌HYP含量、CⅤF和PCⅤF比较（）

注：与Sham组比较，aP＜0.01，与Model组比较，bP ＜0.05，cP ＜0.01

组别 只数 HYP（μg/g） CⅤF（%） PCⅤF（%）Sham组 8 456.95±125.09 1.74±0.38 22.98±3.23 Model组 7 858.58±144.95a5.99±0.49a 89.83±3.54a FH组 8 539.46± 73.49c2.13±0.71c 49.43±2.41c FL组 8 695.30± 86.26b5.39±0.43b 84.08±6.29b F值 52.64 136.18 438.75 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 法舒地尔对大鼠血浆和心肌AngⅡ含量影响

酶联免疫吸附法检测结果如表2所示，与Sham组比较，Model组大鼠血浆和心肌AngⅡ含量显著升高（P＜0.01）；与Model组比较，FH组和FL组大鼠血浆和心肌AngⅡ的含量均显著降低（P＜0.05或P ＜0.01）。

表2 各组大鼠血浆和心肌AngⅡ含量（）

表2 各组大鼠血浆和心肌AngⅡ含量（）

注：与Sham组比较，aP＜0.01，与Model组比较，bP＜0.05，cP ＜0.01

组别 只数 血浆AngⅡ（ng/L） 心肌AngⅡ（ng/L）Sham组 8 41.93±8.26 14.31±2.91 Model组 7 85.16±8.86a 30.85±7.12a FH组 8 43.71±7.70c 13.82±1.53c FL组 8 57.23±8.53c 19.93±2.03b F值 42.09 30.30 P值 0.000 0.000

2.4 法舒地尔对大鼠心肌组织p-MYTP1、α-SMA、TGF-β1和OPN表达的影响

免疫组化染色结果如表3、图3～图6所示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌 p-MYPT1、α-SMA、TGF-β1和OPN棕黄色区域明显增多，MOD值显著升高（均为P＜0.01）。与 Model组比较，FH组和FL 组大鼠心肌 p-MYPT1、α-SMA、OPN 和TGF-β1棕黄色区域明显减少，MOD值均显著下降（均为P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组大鼠心肌p-MYTP1、α-SMA、OPN和TGF-β1免疫染色MOD值的比较（x¯±s）

图3 各组大鼠心肌p-MYTP1免疫组化染色（×400）

图4 各组大鼠心肌α-SMA免疫组化染色（×400）

图5 各组大鼠心肌TGF-β1免疫组化染色（×400）

图6 各组大鼠心肌OPN免疫组化染色（×400）

3 讨论

Rho激酶是最早发现的Rho蛋白效应分子，通过磷酸化一系列蛋白，如MYPT1（故p-MYPT1水平可以反映Rho激酶活性）、肌球蛋白轻链磷酸酶、LIM激酶、丝切蛋白、内收蛋白、埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白（ERM家族）及蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白激酶G等其他丝氨酸-苏氨酸激酶，调节肌动蛋白骨架，参与细胞形状改变、迁移、增殖和凋亡等行为[7]。Rho激酶信号途径的异常激活与各种心血管疾病密切相关，如高血压、冠状动脉痉挛、动脉粥样硬化和心力衰竭等。抑制Rho激酶是许多传统心血管药物共同的目标之一[8]。近年来研究较多的他汀类药物除具有调脂作用外，对心肌纤维化亦有很好的抑制作用，其机制主要与阻断Rho/Rho激酶信号通路有关[9]。

MFB表型分化是组织损伤修复和纤维化的标志性环节，MFB是最主要的胶原合成细胞，其兼有成纤维细胞和平滑肌细胞的特征，特征性地表达α-SMA。正常心脏中，MFB仅存在于瓣叶，故α-SMA表达阳性的间质细胞一般见于疾病状态下[10]。MFB内包含α-SMA的肌动蛋白应力纤维（微丝束）既是重要的细胞骨架成分，也是MFB强大收缩性能的结构基础。应力纤维成分纤维状肌动蛋白（F-肌动蛋白）是由单体肌动蛋白（G-肌动蛋白）聚合形成的。Rho激酶为肌动蛋白聚合和重组提供动力[11]，因此是CFB向MFB转化过程必不可少的物质。本实验采用腹主动脉缩窄法建立压力超负荷模型，8周后，Model组大鼠血浆和心肌AngⅡ浓度明显升高，HYP含量、CⅤF和PCⅤF也显著升高，表明成功复制心肌纤维化模型。同时，心肌间质α-SMA和p-MYPT1的表达水平显著升高，提示大鼠心肌发生了MFB表型分化和Rho激酶信号途径的异常激活。用法舒地尔抑制Rho激酶活性后 （p-MYPT1表达降低），大鼠心肌纤维化程度改善，间质α-SMA的表达下降，表明Rho激酶与MFB表型分化密切相关，与文献报道一致。

虽然目前对MFB的来源还存在很大争议（循环中的细胞、动脉外膜成纤维细胞、间质成纤维细胞及循环中的骨髓干细胞都可能是MFB的前体细胞），但普遍认为，MFB分化主要受局部炎症反应、机械应力及各种体液因子的诱导。其中，TGF-β1是公认的促分化因子，常作为MFB相关研究的工具[12]。活化的 TGF-β1可通过 Smads、Ras/ERK/MAPK 相关激酶或者与其他转录因子的交联促进MFB表型分化。OPN是细胞外基质非结构蛋白——基质细胞蛋白的一员，能通过多种途径发挥促心肌纤维化作用。Lenga等[13]研究发现，OPN在MFB主要结构黏着斑复合体形成过程中是必需的。Chen等[14]研究发现，分泌OPN片段（SⅤⅤYGLR序列）的成肌细胞移植可通过激活 TGF-β/Smads信号通路，诱导MFB分化，明显减轻大鼠心肌梗死后纤维化程度。本实验发现，法舒地尔在抑制心肌α-SMA表达的同时，TGF-β1和OPN的表达亦显著降低，故推测TGF-β1和OPN对Rho激酶介导的MFB分化可能有促进作用。

综上，Rho激酶抑制剂法舒地尔改善压力超负荷大鼠心肌纤维化的作用，可能与抑制心肌MFB表型分化有关。