猪脐静脉血管内皮细胞分离培养和鉴定

谢 杨,张居作,彭 璇,左剑波,薛立群,※(.湖南农业大学动物医学院,湖南 长沙408；.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙403）

血管内皮细胞对生理止血、血管通透性以及血管对生理病理刺激的反应具有重要意义[1]。脐静脉血管内皮细胞是研究胎盘血管发生、血管生理病理的理想模型。脐静脉血管内皮细胞已经成为血管内皮细胞的重要来源，目前已经实现分离的脐静脉血管内皮细胞有人[1-2]、猪[1]、犬[4]脐静脉血管内皮细胞。脐带易得，不易被污染，分离所得血管内皮细胞纯度高、损伤小、性质稳定、扩增变异性小，主要有酶消化法、组织块法和流式分选法[5-7]等。新生仔猪脐带取材较易，静脉血管较动脉血管粗，内径大，韧性好，便于操作，实验采用1%的胶原酶灌注消化法分离猪脐静脉血管内皮细胞，利用1 640完全培养基培养进行传代培养，验证了通过Ⅰ型胶原酶消化猪脐静脉提取血管内皮细胞的方法可行，获得了SUVECs，为进一步研究猪胎盘血管发生及其对母猪生产性能影响提供可靠细胞模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验样本

自然分娩新生仔猪脐带30条（湖南省畜牧兽医研究所种猪场）。

1.1.2 仪器试剂

超净工作台（苏净集团安泰公司）；倒置显微镜（motic AE2000）；CO2培养箱（Thermo公司）；冷冻型台式大容量高速离心机（eppendorf 5810R），i-CELLigence实时无标记细胞功能分析仪（艾森生物公司）。I型胶原酶溶液（Sigma公司），1640培养基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），青链霉素混合液（双抗）、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（碧云天），兔抗人八因子相关抗原抗体（FⅧAg）、兔抗人CD31多克隆抗体、Cy3标记羊抗兔免疫球蛋白IgG抗体（博士德生物）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离

采集自然分娩新生仔猪脐带8～15cm，消毒棉线结扎两端，放入预冷PBS缓冲液（含双抗）中，冰盒保存，尽快（2h内）转移至实验室；在超净工作台中，将脐带放置于PBS缓冲液中清洗2～3次，使用75%乙醇浸泡15s进行表面消毒，PBS清洗表层乙醇，转入无菌玻璃平皿内；使用灭菌眼科手术剪剪去两端结扎处，组织纵向剥离，分离脐带静脉血管；灌注PBS冲洗血管内腔直至流出的液体清亮透明无血色，再灌入适量空气使静脉血管腔内无PBS液残留；血管夹结扎静脉血管一端，从另一端灌注1%的I型胶原酶溶液至血管微微膨胀，结扎注液端，置于预热PBS液中37℃水浴消化10min。消化完全后，去掉血管夹，10%完全培养基冲洗血管内腔，收集细胞悬液，1 000 r/min，4℃离心 7min，收集沉淀细胞。

1.2.2 细胞培养

收集的猪脐静脉血管内皮细胞（swineumbilicusveinsendothelial cells,SUVECs）使用完全培养基吹打成细胞悬液，置于6孔板中培养。24h半数换液，之后视细胞生长情况，2～3d换液，待细胞长至80%左右即可传代。

1.2.3 细胞传代

SUVECs细胞80%左右融合，弃上清，PBS液清洗2～3次，加入适量胰蛋白酶消化至培养皿底部贴壁细胞皱缩变圆彼此分离，完全培养基终止消化，按1:2传代至新培养皿中，5代后按1：3传代。

1.2.4 细胞鉴定

（1）形态学观察：倒置显微镜观察细胞形态、贴壁情况。（2）免疫荧光染色：设空白对照组（NC）、内参对照组（PC）、VWF 实验组（F8）和 CD31实验组（CD），每组3个平行孔；1×105个/mL浓度接种24孔板，待细胞融合至70%～90%，弃掉培养基，PBS缓冲液洗2～3次；4%多聚甲醛室温固定 30min，PBST（ 含 0.05%的 Tween20） 洗 3 次，每次 5min；添加 0.1%Triton X-100，37℃破膜 30min， 再次使用PBST洗3次；正常山羊血清，37℃封闭1h；NC组、PC组、VWF实验组和CD31实验组按照100μL/孔分别加入PBS缓冲液、兔GAPDH抗体（1:1000倍稀释）、兔VWF抗体（1:10倍稀释）和兔CD31抗体（1:100倍稀释），37℃孵育 2h，PBST洗 3次，每次5min；加入1%浓度的Cy3标记羊抗兔免疫球蛋白IgG抗体，37℃避光孵育30min，PBST洗3次，每次5min；荧光显微镜观察并照相。

1.2.5 细胞活力和生长曲线测定

培养细胞按照传代方法制备细胞悬液，调整细胞浓度2.5×104个 /mL，以 300μL/孔接板于 i-CELLigence细胞功能分析仪E-Plate L8孔中，设置3个平行，实时监测细胞生长情况。

2 结果

2.1 形态学观察

第1代细胞中混有少量红细胞，培养24h后细胞分布不均匀，簇状生长，细胞呈小三角形、椭圆形、梭形、多边形单层排列；培养3～5d后，细胞由中心向外扩散增殖，细胞核清晰可见；培养7～9d，细胞逐渐融合成铺路石状，细胞间存在明显的接触抑制；随着细胞代数增加，细胞生长速度增快，细胞接种后贴壁迅速，4～6h可见大部分细胞已贴壁，细胞形态饱满，生长旺盛，3～4d即可达90%融合，细胞传代后形态无明显改变（图1）。

2.2 细胞鉴定

培养细胞经免疫荧光染色后，明视野可见细胞呈现三角形或长梭形生长，细胞核清晰，细胞形态典型，细胞间存在明显的接触抑制。暗视野下，NC组无明显荧光染色痕迹；PC组细胞质和细胞核均可见亮红色荧光，核区更亮；F8组核区可见亮红色荧光；CD组着色较浅，核区相对较强。据此，VWF和CD31两个特异性的血管标记物检测阳性，阳性细胞比例超过90%，成功获得原代SUVECs。

图1 原代SUVECs的培养和显微镜观察。A:第1代细胞 (×40);B:第2代细胞 (×100);C:第4代细胞(×200);D:第 6代细胞(×200)。

2.3 细胞活力和生长曲线

图2 原代SUVECs活力和生长曲线

ICELLigence实时无标记细胞功能分析仪对细胞生长曲线变化的监测，结果显示：以2.5×104个/mL的细胞浓度接种于E-Plate L8孔中的悬浮细胞4～6h完全贴壁，在经过20h左右的平稳潜伏期后缓慢进入大量分裂的指数生长期。在对数生长初期的24h中，细胞分裂速度较慢，增殖平缓，随后细胞数迅速增加。在82h左右，细胞达到饱和密度，停止生长，进入平顶期，之后逐渐退化衰亡（图2）。对细胞损伤小，所得细胞活力高，消化时间和温度可控范围变大，更适用；脐带37℃条件下分别灌注消化 5min、10min、15min，发现消化 10min 所得的细胞较多，细胞活性好，贴壁能力强，增殖快；消化5min，细胞消化不完全，所得细胞少；消化15min，细胞悬液中混有大量杂细胞和结缔组织，培养后细胞大量死亡，活力差。同时发现在消化时间相同的条件下，使用37℃PBS缓冲液水浴较37℃恒温培养箱效果更佳，有利于摇晃，使胶原酶和血管内皮充分接触，温度均匀，消化快速完全，杂细胞少，不易污染。

培养条件影响SUVECs的生长状况和活力[8]，探索发现36～38℃下，SUVECs都能正常生长，但随着温度的升高，生长速度增快，但对数生长期时间变短；培养箱氧分压降低会导致SUVECs提前进入平台期；培养基的最适pH值是7.0～7.2，培养液pH值的改变会导致细胞贴壁困难，贴壁细胞失活脱落。本研究在传代培养中发现，第1代生长的时间将近10d，而第2代生长的时间为7d，代数增加生长速度越快，但第5代以后生长时间稳定在2～3d，因此选择5代以前采取1:2传代，5代以后采取1:3传代。

VWF、CD31、CD34等是血管内皮细胞的特异性蛋白，作为血管内皮细胞鉴定的关键指标[9-10]。实验分离获得的SUVECs采用免疫荧光鉴定，VWF和CD31两种因子检测均呈阳性超过90%，表明获得了较高纯度的SUVECs。通过多次探索，采用1%的I型胶原酶灌注消化法，分离得到了较高纯度的SUVECs，活力较强，能够传代超过15代，为建立稳定的SUVECs系提供了可靠材料，是研究猪胎盘血管发生及其对母猪生产性能影响的可靠细胞模型。

3 分析和讨论

研究采用酶灌注消化法，操作简单，容易实现无菌，得到的细胞量大且纯度较高。同时发现在灌注消化酶液前，彻底的清洗脐带，完全分离脐静脉，保持脐静脉管壁的完整性非常重要。探索中还发现使用胰酶消化可以获得高纯度的SUVECs，但细胞活力差，一般培养少于3代；I型胶原酶相对温和，

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