小金蝠蛾的生态型研究

张德利，涂永勤

(重庆市中药研究院，重庆 400065)

小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensisi Tu 是四川省阿坝藏族羌族自治州小金县冬虫夏草的寄主昆虫(涂永勤，2009)。按现在分类小金蝠蛾应属鳞翅目Lepidoptera 蝙蝠蛾科 Hepialidae 钩蝠蛾属Thitarodes (Viette，1968)。在收集繁育小金蝠蛾过程中，发现来自不同乡的小金蝠蛾体色及斑纹有较大差异，同一花色的个体有的鲜艳，有的暗淡。通过集中羽化后，对这些成虫个体的色泽和斑纹进行比较，发现小金蝠蛾主要有两个主要类型。两者在外形上有一定的差别，主要表现在体色和翅斑纹。一种体表及翅面附有褐色(铁锈色)鳞片，褐色与白色相间斑纹，另一种为黑白斑纹或条纹。在分布上也有一定差异，前者主要分布在海拔3400-4800 m，后者主要分布在2800-3600 m，亦有混合分布区域(涂永勤，2013)。成虫交尾有两个明显的高峰时间(涂永勤，2011)，一个交尾高峰为18∶00-18∶30;另一个高峰为20∶00-20∶30。因此，两者可能为不同物种。有研究认为中国的蝠蛾主要属窄域分布类型，有95%的种类分布区域狭窄，常常是不同地区或者不同山脉就形成完全不同的种类，甚至是同一山脉在不同坡向和海拔就形成完全不同的物种(杨大荣，1996)。为了确证分布在小金县冬虫夏草产区的寄主蝠蛾的两个主要类群是否为不同物种，本文从外部形态、生殖器构造和分子生物学进行比较研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 寄主昆虫

采自小金县崇德、新桥、双柏、八角、木坡、抚边、两河等乡海拔2800-4800 m 的草地、耕地或退耕还林地的小金蝠蛾蛹。将不同地点(乡)采集到的蛹在康定冬虫夏草基地羽化为成虫，将收集到的成虫用毒瓶毒死后展翅于泡沫板上，供实验用标本。

1.1.2 主要试剂

本实验用到的试剂有基因组DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、克隆载体、感受态细胞和PCR 试剂等，详情见表1。

表1 本实验用试剂及试剂盒种类、型号及生产商Table 1 Test kit reagents and type，model and manufacturer

1.1.3 主要仪器

PCR 扩增仪:Applied Biosystems (9700);高速低温离心机，常温离心机:由德国Sigma 公司生产;恒温水浴锅:日本三洋公司生产;电泳仪和电泳槽:美国Bio-Rad 公司生产;凝胶成像系统:Gel Doc EQ:美 国 Bio-Rad 公司生;4℃、-20℃、-70℃冰箱:日本三洋公司生产。体式显微镜及照相系统:日本奥林巴斯生产。

1.2 方法

1.2.1 成虫形态观察

将各采集点羽化的成虫若干，集中展布在泡沫板上，观察比较成虫的外部形态、色泽和翅斑纹，并描述、拍照及归类。

1.2.2 雄性外生殖器制备与观察

用不同外形(色泽和斑纹)的小金蝠蛾雄虫A 型和B 型各3-5 头，从腹部第8 节处剪断，将腹部末端放入10% NaOH 溶液煮20-30 min，取出外生殖器部分，用清水冲洗掉碱液，并去除多余的组织，置于体式显微镜下观察生殖器构造。

1.2.3 分子鉴定

取A 型和B 型小金蝠蛾各5 头，采用蛋白酶K 法对其DNA 进行提取，用昆虫COI 通用引物(LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCO2198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)进行PCR 扩增，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切割目的片段，用Takara 琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收，样品由北京六合华大基因科技有限公司合成与检测。

2 结果与分析

2.1 小金蝠蛾的形态特征

通过外形比较，采自小金县各乡镇分布的小金蝠蛾有多种不同色泽和斑纹，但主要有两种类型(见图1-6)，两者的主要差别在于A 型体表有大量褐色绒毛，翅斑纹为褐色与灰白色相间条纹，翅表面附铁锈色鳞片，与小金蝠蛾模式标本相同，见图1-3。B 型为黑色与灰白色条纹或白色斑纹，见图4-6。A 型去掉铁锈色鳞片后，与B 型翅表条纹或斑纹有一定的相似性。同花纹蝠蛾的亦有色泽鲜艳或暗淡的差异。

图1 小金蝠蛾A 型Fig.1 A type

图2 小金蝠蛾A 型Fig.2 A type

图3 小金蝠蛾A 型Fig.3 A type

图4 小金蝠蛾B 型Fig.4 B type

图5 小金蝠蛾B 型Fig.5 B type

图6 小金蝠蛾B 型Fig.6 B type

2.2 小金蝠蛾雄性外生殖器构造

A、B 两型小金蝠蛾的雄性外生殖器在体式显微镜下的构造如图7-12 所示。由生殖器构造图可知，两者最大差异在于A 型的抱器瓣钩更明显，呈牛角状向内弯曲弧度较大，B 型的抱器瓣钩弯度较小，近似直伸。此外，两者无较大差别，据此无法作为分种的依据，两者可能为同一物种。

图7 A 型雄性外生殖器-1Fig.7 Type A male genitals-1

图8 A 型雄性外生殖器-2Fig.8 Type A male genitals-2

图9 A 型右抱器瓣Fig.9 Type A right lobe

图10 B 型雄性外生殖器-1Fig.10 Type B male genitals-1

图11 B 型雄性外生殖器-2Fig.11 Type B male genitals-2

图12 B 型左抱器瓣Fig.12 Type B left clasper disc

2.3 分子生物学鉴定

小金蝠蛾COⅠ序列测定结果为含有658 bp的序列，该序列已申请并获得序列号:GenBank KP772242 供查询。与人支蝠蛾、蒲氏蝠蛾及家蚕等已知序列进行比对，并应用MEGA 5.05 软件计算其遗传距离，结果见表2。从表2 可知:根据K-2-P 模型得出包括外群在内的遗传距离D，由COI 基因片段所得到的遗传距离中，同样花纹的样品XJ-A 和XJ-B种间的遗传距离分别为0.000和0.009;不同花纹XJ-A 和XJ-B 的样品间的遗传距离在0.002-0.008 之间;XJ-A 和XJ-B与两个同属种的遗传距离0.048-0.084 之间;XJ-A 和XJ-B 与外群Bombyx mori 遗传距离为0.178 和0.180。可见小金蝠蛾A 型和B 型之间遗传距离最近，两者的相似度达99.2%，不足以达到物种差异的标准。所以，两者应为同一物种，小金蝠蛾A 型和B 型应属于同一物种不同的生态类型。它们在分布范围和生活习性上都有一定的差异。但尚未分化为不同的物种。

表2 4 个样品的COⅠ基因的K-2-P 遗传距离和标准误差Table 2 Genetic identity and distance of geographic populations of Thitarodes xiaojinensis

3 结论与讨论

综上所述，在小金县冬虫夏草主要产区分布的小金蝠蛾，我们通过从形态上、雄性外生殖器构造和分子生物学等进行比较研究，结果表明:在外形上有一定的差异、且雄性外生殖器构造有变异的两类蝠蛾均为小金蝠蛾。蝠蛾外形色泽及斑纹差异明显的两类应为小金蝠蛾的不同生态型。且可分为高山型(A 型)和低山型(B 型)。高山型(A 型)主要分布在海拔3400-4800 m 的高山草甸地带，低山型(B 型)分布在2800-3600 m的耕地、退耕还林地及草地，两者能正常交配、产卵、并孵化为幼虫，经化蛹、羽化的后代亦能正常交配产卵。此外，我们在四川康定采集贡嘎蝠蛾时，亦有很多色泽或斑纹各异的蛾子，但他们能彼此正常交配、产卵，卵亦能孵化为幼虫。由此可见，分布在一定范围的蝠蛾由于环境的差异，种群发生分化，产生变异，在外部形态上表现出来，如果进一步发生变异，即可分化为不同的物种。小金蝠蛾这种在不同海拔分布的物种，由于环境的差异，种群发生了明显分化，在外形上及生殖器上均有一定变化，但尚未分化为不同的物种，其遗传分化规律有待深入研究。所以，认为在不同坡向和海拔高度分布的蝠蛾已分化为不同物种的可能性还值得商榷，可能需要更多的证据来支持。

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