气相色谱-质谱联用法检测牛乳中乙草胺的研究

李琳瑶，田成新，满朝新，娄彬彬，牛婕婷，张立东，姜毓君

（东北农业大学 a.食品学院乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030）

0 引言

近年来，随着人们生活水平的不断提高，牛奶的人均消费量也大幅度增加，农药残留作为影响牛奶安全的因素之一，受到高度重视。乙草胺是美国孟山都公司于1971年开发的一种芽前选择性酰胺类除草剂，用于防除玉米中一年生禾本科杂草和某些一年生阔叶杂草，是世界上最常用的除草剂之一[1]。目前产量仍有逐年增加的趋势，特别是在中国[2]。但乙草胺有潜在的致癌风险，欧盟规定牛乳（cattle milk）中乙草胺的最大残留限量（MRL）为0.01 mg/kg[3]，我国并未规定牛乳中乙草胺的限量标准。因此，为了消费者的健康安全，检测牛乳中乙草胺的残留量十分重要。

本研究建立了一种牛乳中乙草胺的气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS）[4-6]检测方法，可以监测牛乳中乙草胺水平，保障乳制品安全。

1 实验

1.1 试剂与仪器

乙草胺标准品（纯度为92.5%），乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色谱纯），氯化钠（分析纯），PSA、Cleanert Pesti-Carb，无水硫酸镁（纯度为99.5%）。

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，GENIUS 3漩涡震荡器，AL204型电子分析天平，L-550低速自动离心机，冷冻离心机，N-EVAP氮吹仪。

本研究所用牛乳采自哈尔滨市郊奶牛养殖场。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

本研究采用2003年由美国农业部Anastassiades教授开发的一种新型样品前处理方法-QuEChERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe）并加以改进，原理是利用吸附剂与样品基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到净化的作用，分为提取和净化两个步骤。

（1）提取。准确称取2.0 g牛乳样品（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入0.5 g氯化钠、10.0 mL乙腈，漩涡振荡5 min，以转速为4 000 r/min离心5 min，再准确移取5.0 mL上清液于玻璃试管中，40℃氮吹至干，待净化。

（2）净化。将所得样品用1.0 mL丙酮定容，漩涡均匀后转移到装有基质分散剂（0.15 g无水硫酸镁、0.15 g PSA、0.02 g Cleanert PestiCarb石墨化炭黑）的2 mL离心管中，漩涡均匀，以转速为15 000 r/min离心10 min，静止片刻，取适量上清液供气相色谱-质谱联用仪测定。

1.2.2 气相色谱-质谱条件

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 μm ×250 μm）；色谱柱温度：80 ℃保持2 min，然后以15℃/min升温至200℃，再以30℃/min升温至270℃保持10 min；不分流进样方式；进样量1 μL；进样口温度250℃；载气为氦气（纯度≥99.999%），流速1 mL/min。

质谱条件：色谱-质谱接口温度280℃；电离方式为EI；电子能量70 eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；选择离子监测模式；选择监测离子（丰度比）：定量离子223（63），定性离子146（100）、162（75）、269（9）；溶剂延迟3 min。

1.3 定性与定量原则

定性分析：在利用GC-MS检测牛乳中乙草胺时，利用乙草胺色谱峰的保留时间进行定性判断，样品中乙草胺的出峰时间与标准溶液相一致，两者允许误差在±0.5%之内；同时要看样品质谱图中扣除背景噪音后四个碎片离子是否均出现，四个特征碎片离子m/z 146、m/z 162、m/z 223和m/z 269（相对丰度比100∶75∶63∶9）与标准溶液相应离子的相对丰度比一致，相似度在允许相对误差之内，则可判断样品中存在乙草胺。此外可进行NIST谱库检索，选择匹配度较高的结果，进行结构式查询来进一步判断。

定量分析：采用外标法定量分析，用标准储备液配成不同浓度的标准溶液，在与待测样品完全相同的操作条件下，测得标准溶液的响应值，以响应值对浓度做标准曲线，将待测化合物测得的响应值代入标准曲线即可求得其浓度。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 提取试剂的选择

牛乳中含有大量的物质，基质成分相对复杂，在检测牛乳中乙草胺的含量时，需要排除牛乳中蛋白质、脂肪和其他干扰物的影响，故需要选择一种提取效果较好的提取试剂，将乙草胺从牛乳中大量充分的提取出来。根据待测物与提取试剂的“相似相溶”原理，本试验选择乙腈、丙酮、乙酸乙酯作为提取试剂，比较发现：乙腈的提取效果最好，同时可以沉淀牛乳中的蛋白质；丙酮的脂溶性较大、提取的油脂多、干扰杂质也多、不利于后续试验的进行；乙酸乙酯容易出现乳化现象，为后续净化带来不便[7]。因此综合考虑，最终选择乙腈作为本试验的提取试剂，乙腈不仅可以充分提取出牛乳中的乙草胺，而且可以作为沉淀剂沉淀牛乳中的蛋白质，随后通过加入氯化钠可以实现乙腈与水层的快速分离[8]。

2.1.2 提取方式的选择

本试验考察了3种不同提取方式提取牛乳中乙草胺的提取效果，分别为振荡提取（5 min，提取1次），超声提取（10 min，提取1次）和均质提取（14 000 r/min，1 min，提取1次），其他实验条件相同。将提取处理后的乙草胺样品浓缩净化并上机测定，每个样品平行测定3次，比较不同提取方式的加标回收率大小，选择回收率最高的提取方式作为本试验的最佳提取方式。以提取方式的种类为横坐标，回收率（%）为纵坐标，绘制柱状图，如图1所示。

图1 乙草胺不同提取方式对比结果

由图1可知，振荡提取、超声提取和均质提取三种不同提取方式的回收率分别为98.82%、93.71%、94.18%，振荡提取方式的回收率略高于超声提取和均质提取，同时振荡提取方式操作简单，均质提取容易对样品造成一定的污染，最终选择振荡提取方式作为本试验的最佳提取方式。

2.1.3 基质分散剂的选择

在用乙腈提取牛乳中的乙草胺时，虽然乙腈的提取效果很好而且可以沉淀牛乳中的部分蛋白质，但不可避免同时提取出牛乳中的其他基质成分，从而干扰乙草胺后续的定性和定量分析，因此，需要在提取的基础上进行必要的净化处理。本试验选择无水硫酸镁、PSA（N-丙基乙二胺）和Cleanert PestiCarb（石墨化碳黑）同时作为净化剂和吸附剂处理牛乳中的乙草胺，无水硫酸镁可以除去牛乳基质中的水分，PSA有较弱的阴离子交换能力，可以吸附牛乳基质中的脂肪酸、有机酸、碳水化合物、糖类、酚类和色素等杂质，Cleanert PestiCarb（石墨化碳黑）可以吸附牛乳基质中的色素、类胡萝卜素、固醇和平面结构极性大的基质干扰物[9-12]。

同时吸附剂用量是影响样品净化效果的重要因素，本试验根据待测目标化合物性质和样品情况选择合适的吸附剂用量，若用量过少，待测物乙草胺净化效果差且回收率低；若用量过多，待测物乙草胺净化效果虽好但成本增加且回收率也低，尤其是石墨化碳黑用量过多，会严重吸附目标化合物[11]。综合考虑选择无水硫酸镁0.15 g，PSA 0.15 g和Cleanert PestiCarb（石墨化碳黑）0.02 g作为本试验的基质分散剂的用量，取得了很好的净化效果且回收率高，能够达到牛乳中乙草胺残留分析的要求。

2.2 GC-MS条件的优化

2.2.1 色谱条件的确定

将质量浓度为300 μg/L的乙草胺标准溶液经GC-MS上机测定，选择离子监测模式，所得乙草胺标准溶液的总离子色谱图（TIC）如图2所示，定量离子（223）色谱图如图3所示，色谱峰光滑、对称、呈正态分布、无杂峰干扰、基线为一条水平直线。

图2 乙草胺标准溶液总离子色谱

图3 乙草胺标准溶液定量离子（223）色谱

2.2.2 质谱条件的确定

将质量浓度为300 μg/L的乙草胺标准溶液经GC-MS上机测定，在全扫描模式（SCAN）下对m/z 50～500范围内的碎片离子进行分析，得到乙草胺全扫描质谱图，如图4所示。

图4 乙草胺全扫描质谱图

由图4所示，乙草胺经电离产生一系列碎片离子，选择丰度高、专属性强、受外源组分干扰少、空白样品无特征的碎片离子作为选择离子监测模式（SIM）分析时的特征碎片离子。综合考虑，本试验选择m/z 146、m/z 162、m/z 223、m/z 269作为乙草胺的选择离子监测的特征碎片离子，其中m/z 146、m/z 162、m/z 269为定性离子，m/z 223为定量离子，得到乙草胺选择离子监测质谱图，如图5所示。

图5 乙草胺选择离子监测质谱图

2.3 线性范围与定量限

在确定的色谱及质谱条件下，将 5，10，20，50，100，200，300 μg/L共7个质量浓度梯度的乙草胺标准溶液上机测定，每个浓度平行测定三次，以乙草胺标准溶液的质量浓度为横坐标，响应值为纵坐标，绘制标准曲线。得到乙草胺的线性回归方程为y=320.5x-728.91，相关系数（R2）为0.9991，乙草胺在5～300 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，呈正相关，能够达到日常工作需要。

向空白样品中添加乙草胺标准溶液，平行测定5次，以S/N=10对应的质量分数为该方法的定量限，求得定量限为0.5 μg/kg，可以满足农残检测要求。

2.4 回收率与精密度

在确定的色谱及质谱条件下，向空白样品中添加三个不同质量浓度梯度的乙草胺标准溶液，添加质量浓度分别为20，50，100 μg/L，进行加标回收试验，每个质量浓度5次平行，结果如表1所示。可知，乙草胺的加标平均回收率范围为93.42%～98.82%，相对标准偏差范围为2.00%～2.61%，回收率满足农残试验要求，相对标准偏差范围合理。

表1 乙草胺的加标回收率与精密度

2.5 稳定性实验

稳定性分析一般是指样品标准溶液或待测物在不同温度条件下（如室温，冷却和反复冷冻解冻），其标准物或待测物的稳定情况。将储存于4℃条件下的乙草胺储备液，选择第0天、第10天、第20天、第30天上机测定，测定前用丙酮稀释至100 μg/L的乙草胺标准溶液，观察30天内乙草胺的浓度变化情况。结果如图6所示。可知，乙草胺标准溶液在30天内的响应值略有下降，但并不明显，说明乙草胺在4℃条件下，30天内稳定性良好。

图6 4℃条件下乙草胺的稳定性

3 结论

本研究建立了一种利用气相色谱-质谱联用法检测牛乳中乙草胺的方法。采用改进的QuEChERS样品前处理方法，通过乙腈提取乙草胺并沉淀牛乳中的蛋白质，氮吹浓缩，基质分散剂（无水硫酸镁、PSA和Cleanert PestiCarb石墨化炭黑）净化处理，采用气相色谱-质谱联用仪进行检测。结果表明，该方法简单、灵敏、准确度高、成本低、实用性强，适用于大批实际牛乳样品的检测分析。

[1]YE C.Environmental behavior of the herbicide acetochlor in soil[J].Environ.Contam.Toxical,2003,71：919-923.

[2]XIAO N W,JING B B,GE F,et al.The fate of herbicide acetochlor and its toxicity to Eisenia fetida under laboratory conditions[J].Chemosphere,2006,62：1366-1373.

[3]European Commission,2010.EU Pesticides database.Available from：＜http：//ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm＞.

[4]RODRIGUES Frederico de M,MESQUITA Paulo R.R,OLIVERIRA Lidia S.de,et al.Development of a headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry method for determination of organophosphorus pesticide residues in cow milk[J].Microchemical Journal,2011,98：56-61.

[5]CHEN X Y,PANUWET Parinya,HUNTER Ronald E,et al.Method for the quantification of current use and persistent pesticides in cow milk,human milk and baby formula using gas chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2014,970：121-130.

[6]ZHENG G C,HAN C,LIU Y,et al.Multiresidue analysis of 30 organochlorine pesticides in milk and milk powder by gel permeation chromatography-solid phase extraction-gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].J.Dairy Sci,2014,97：6016-6026.

[7]董振霖,杨春光,肖珊珊.气相色谱和气相色谱-质谱法测定食品中乙草胺残留[J].分析化学研究简报,2009,37（5）：698-702.

[8]田宏哲,赵瑛博,周艳明.高效液相色谱-质谱法测定牛奶中6种氨基甲酸酯农药残留[J].食品科学,2011,32（2）：187-190.

[9]朱丽萍,朱涛,潘玉香.气相色谱法同时测定蔬菜及水果中多种农药残留量[J].分析化学研究简报,2008,36（7）：999-1003.

[10]陈宗懋,食品中农药残留问题的过去、现在和将来[C].//沈爱民,赵方田.农产品质量安全与现代农业发展专家论坛论文集,中国：科学技术出版社,2011,11-20.

[11]邵金良,刘宏程,梅文泉，等.基质固相分散萃取-HPLC分析番茄中6种农药残留[J].食品与机械,2013,29（4）：67-70,70.

[12]高晓昇,张艳,王松雪等.牛奶中拟除虫菊酯类农药残留检测-QuEChERS-气相色谱分析方法的研究与建立[J].中国奶牛,2010,（8）：56-60.