胶体金免疫层析法快速检测乳制品中三聚氰胺

程国栋，吴小慧，张宇，李晓丹，吴方舟，王丹，金珠

（1.蒙牛乳业（马鞍山）有限公司，安徽马鞍山243000；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特010000）

0 引言

三聚氰胺（melamine）分子式为C3N6H6，分子量为126.12 u，属于三嗪类含氮杂环有机化合物[1]，广泛用于木材、塑料、涂料，造纸等行业[2]，具有一定的肾毒性。因其含氮量高达66.6%，一些不法分子利用“凯氏定氮法”是通过测定牛奶中含氮量来折算蛋白质质量分数的方法漏洞，将三聚氰胺人为添加到生乳中，达到提高蛋白质质量分数目的，获得不法利益。

目前检测三聚氰胺有ELISA法[3-4]、液相色谱法[5-6]、气相色谱-串联质谱法[7]和液相色谱-串联质谱法[8-9]等。ELISA法对乳品的检测具有局限性，且特异性较差；仪器法虽能精确定量，但前处理繁琐，设备昂贵，对操作人员专业要求高。

近年来也有利用胶体金免疫层析法检测乳品中三聚氰胺，但集中于生乳和奶粉[10-12]，针对乳制品研究较少。因此建立胶体免疫层析法检测乳制品中三聚氰胺是有必要的，也具有实际意义。

1 实验

1.1 主要仪器

温育器，试纸条读数仪，移液器，计时器，超纯水器，漩涡混合仪，电子天平，高效液相色谱仪。

1.2 试剂与耗材

易瑞成品乳三聚氰胺快速试纸条，三聚氰胺标准品，双氧水，青霉素G，糊精，铵盐，碳酸氢钠，尿素，实验用水为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 检测原理

三聚氰胺定性检测试纸条应用了竞争抑制胶体金免疫层析的原理（结构如图1所示）。样本中的三聚氰胺在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜（NC膜）检测线（T线）上的三聚氰胺-BSA（牛血清蛋白）偶联物的结合，从而导致检测线与控制线颜色深浅的变化，进行结果的判定。

图1 三聚氰胺快速试纸条结构

1.3.2 试纸条的验收

取经确认不含三聚氰胺的12%复原乳做本底空白样品，并用其制备质量浓度为150 μg/L的三聚氰胺加标样品，用试纸条对以上两个样品做平行检测。当复原乳本底样品检测结果为阴性，三聚氰胺加标样品检测结果为阳性，试纸条方可使用。

1.3.3 检测步骤

样品与水1∶1进行振荡混合均匀（如：5 g样品，加入5 mL水，混匀），待测。将试纸条从冰箱中拿出，恢复至室温。从试纸桶中取出白色微孔，移取300 μL待测样品于白色微孔中，用移液器抽吸5～10次，混合均匀；将上述制备好的白色微孔样液全部转移至对应的红色微孔中混匀，置于温育器中40℃±1℃温育6 min；温育结束后，将试纸条插入到微孔中（吸水海绵端朝下）40℃±1℃温育7 min；然后从微孔中取出试纸条，轻轻刮去试纸条下端的吸水海绵，进行结果判读；实验完毕后，将试纸条放入盒中密封，于2～8℃保存。

2 结果与分析

2.1 结果判定

试纸条检测结果的判定可分为肉眼判定和读数仪读数判定两种方式，具体判定方式可根据实际情况进行选择。

2.1.1 肉眼判定

胶体金免疫层析法结果的判定如图2所示：当检测线（T线）和控制线（C线）均出现红色条带时，若T线的红色条带颜色较C线深，为阴性（-），反之则为阳性（+）；当试纸条T线有红色带，C线无红色带时，为阴性（-），反之当试纸条T线无红色条带，C线出现红色条带，则为阳性（+）；若T线和C线两条线全无色带，则试纸条检测结果无效。

图2 三聚氰胺快速试纸条检测结果的判定

2.1.2 读数仪读数判定

当试纸条上T线和C线颜色相同时，所对应样品中三聚氰胺的质量分数为样品的检出限，此时读数仪读数为1.1，当使用读数仪读数时结果大于1.1时为阴性（-），小于或等于1.1时为阳性（+）。个别样品的判读数值有所不同，例如：儿童奶样品，当T线与C线颜色相同时数值为1.8。

2.2 检出限实验

由于目前市场上乳制品种类繁多，实验选取灭菌乳、调制乳、巴氏杀菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶5类样品进行检出限实验验证。分别取2个批次的三聚氰胺胶体金试纸条分别对添加质量分数为50，100，200 μg/kg上述加标样品进行重复6次检测，结果如表1所示。

表1 胶体金免疫层析试纸条检出限实验

由表1可以看出，巴氏杀菌乳检出限为50 μg/kg，灭菌乳、调制乳，原味酸牛奶的检出限为100 μg/kg，果粒酸牛奶的检出限为200 μg/kg。由于每个乳品加工企业生产灭菌乳、调制乳、巴氏杀菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶的工艺各不相同，这就造成了样品基质种类繁多，为了保证实验的科学、严谨和准确性，在日常检测工作中应该对每类产品的每种产品的检出限进行评定，以确定相应样品的检出限。从表1也可以看出，不同批次检的胶体金免疫层析试纸条检测结果存在一定的差异，所以在进行检出限评定时，至少要选用2个批次的试纸条进行实验，以确保实验结果的准确。

2.3 重复性实验

实验分别选取灭菌乳、调制乳、巴氏杀菌乳、原味酸牛奶和果粒酸牛奶样品中的一种代表性产品进行重复性检测。实验选取2个批次的胶体金免疫层析试纸条，分别检测本底样品，1倍检出限和2倍检出限加标样品，每个样本使用不同批次的试纸条同时检测6次，结果如表2所示。

表2 胶体金免疫层析试纸条对牛奶样品的重复性实验结果

由表2可以看出，2个批次的三聚氰胺检测本底样品时，结果均为阴性；检测添加三聚氰胺1倍检出限和2倍检出限样本时，结果均为阳性，检测结果一致，重复性良好。

2.4 稳定性实验

实验各选取上述5类样品中一种代表性产品，分别添加三聚氰胺标准品，制成阳性样品。然后用2个批次三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条分别平行检测2次，检测结果均呈阳性。对上述样品用相同的方法连续检测7 d，检测结果也全部为阳性，说明三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条日内、日间的稳定均良好。试纸条保存于2～8℃的环境中，12个月保质期内仍可以特异性检出阳性，并且灵敏度没有降低。

2.5 特异性实验

2.5.1 阴性干扰

实验将确定不含有三聚氰胺牛奶样品制成含有脂肪层、酸败样品、质量浓度20 mg/L的双氧水、0.1%碳酸氢钠、100 μg/kg青霉素G、0.2%糊精、0.1%铵盐、1%尿素（均为质量分数）的干扰样品，分别做阴性和阳性干扰，检测结果如表3所示。

表3 三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条阴性抗干扰实验结果

2.5.1 阳性干扰

将上述制备的阴性干扰样品制备成含有质量分数为200 μg/kg的三聚氰胺加标样品，用胶体金免疫层析试纸条进行检测，具体结果如表4所示。

通过表3特异性实验数据可知，尿素对纯牛奶、灭菌乳和巴氏杀菌乳样本产生了干扰，出现假阳性现象，但其对酸牛奶未产生干扰。为了进一步验证尿素的干扰情况，实验增加了朱古力牛奶、香草牛奶等液体奶和黄桃果粒酸牛奶、草莓果粒酸牛奶、凝固型原味酸牛奶等发酵乳的尿素阴、阳性抗干扰实验。实验结果显示朱古力牛奶、香草牛奶等液体奶的阴性干扰仍然呈“+”，酸牛奶的阴性干扰呈“-”，所有产品的阳性干扰均呈现“+”。由此可以得出尿素对胶体金免疫层析试纸条检测液态奶中三聚氰胺存在干扰现象。

2.6 与仪器法对比实验

因胶体金免疫层析试纸条的检出限于仪器法的检出限存在一定的差别，目前我国乳品加工企业大多采用GB/T 22388-2008中液相法来检测乳及乳制品中三聚氰胺，该方法的检出为2 mg/kg。我国食品安全法禁止人为在乳品中添加三聚氰胺，但牛奶可能会因包材中三聚氰胺的迁移导致检出三聚氰胺，所以我国将牛奶中三聚氰胺的限量标准定为2.5 mg/kg，故实验选择阴性样品和添加含有质量分数为2 mg/kg的三聚氰胺牛奶样品来进行试纸条法与液相法的对比实验，这样能够有效地保证在标准之下两种方法均能有效检出。结果如表5所示。

由表5可以看出，试纸条法检测结果与液相法检测结果相一致，表明试纸条可用于灭菌乳、调制乳、巴氏杀菌乳和发酵乳中三聚氰胺的快速筛选检测。

2.7 批量检验结果

连续一个星期使用三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条对上述5类不同品种样品进行检测，每天检测量为约25个样品，实验过程均正常，样品检测结果均为阴性，同时液相法的检测结果均为未检出。

2.8 注意事项

为了杜绝检测过程中一些不适宜因素导致检测结果出现异常，需注意以下几点：①请勿混用来自不同批号的试纸条和试剂微孔，请勿使用超过保质期的试纸条；②试纸条和微孔均为一次性使用，不要触摸试纸条中央的白色膜面；③对于发酵乳，为了让液体充分浸透海绵，插入试纸条后应反复多次的将白色海绵端紧贴微孔片刻；④遇到样品层析速度过慢，第二次温育时液体未能上升至C线处时，可延长2～3 min温育时间；⑤第二步温育结束后需在5 min内观察或读取结果，超过时间结果判读无效；⑥多个样品同时进行检测时，尽可能的保持操作步骤统一；⑦试纸条检测结果出现阳性时，应该选用相关仪器法进行确证。

表4 三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条阳性性抗干扰实验结果

表5 试纸条法与液相法检测结果对比

3 结论

通过一系列性能评价实验，三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条法检测时间在20 min内，检出限为50～200 μg/kg，批间重复性和批内重复性良好，检测结果与液相法检测结果一致。方法简便，对人员专业技能要求相对低，灵敏度、稳定性和特异性等均达到了食品中有毒有害物质快速检测的要求，非常适用于乳品加工企业对样品的粗筛选检测工作，为产品尽早的投放市场提供前提保障。

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