五株乳杆菌益生特性及降脂性能研究

王霄鹏，吕嘉枥，闫亚梅，李文娟，杜冰

（陕西科技大学食品与生物工程学院,西安710021）

0 引言

发酵食品是一类利用微生物发酵制得的产品，在中国有着悠久的历史和丰富的文化内涵[1]。现代科学研究表明：传统发酵食品不仅具有较高的营养价值和独特的口感风味，还含有很多活性成分，使发酵食品具有一定的保健功能，如降血脂、调节肠道微环境、降血糖及提高免疫力等[2-4]。益生菌本身具有很多对人体有益的功效[5]。

本研究从西北地区传统发酵果蔬和乳品中分离筛选出5种乳杆菌，分别为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）主要针对降脂性能以及降脂机制研究其益生功能，加强乳杆菌及发酵食品的功能性，为乳杆菌的进一步开发利用提供一定的理论依据。

1 实验

1.1 菌株与试剂

从西北地区传统发酵果蔬和乳品中分离筛选出的嗜酸乳杆菌（LA），保加利亚乳杆菌（LB），干酪乳杆菌（LC），植物乳杆菌（LP），鼠李糖乳杆菌（LGG），由陕西科技大学食品与生物工程学院提供。胆固醇，蔗糖酯，胆固醇试剂盒和甘油三酯试剂盒，冰醋酸（分析纯），无水乙醇，猪油（自制），猪胆盐。

1.2 仪器与设备

B203LEDR生物显微镜，AC-0629普通光学显微镜，单人净化工作台，XW.80A旋涡混合器，DHP9080电热恒温培养箱，LS-C50L型立式压力蒸汽灭菌锅，分光光度计，冷冻离心机，pH计。

1.3 培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，柠檬酸二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1 mL，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.0，在121℃灭菌20 min。

胆固醇（TC）培养基：准确称量0.1 g胆固醇于小烧杯，加入1 mL Tween-80，0.1 g蔗糖酯，搅拌均匀后加入5.0 mL冰乙酸，边加热边搅拌至充分溶解，超声处理15 min后再加入MRS培养基中，边加边搅拌，使胆固醇质量浓度为0.1 g/L，然后加入0.2%巯基乙酸钠，调pH值为6.0，121℃灭菌15 min。

甘油三酯（TG）培养基：将Tween-80与猪油按1∶5比例混合，边加热边搅拌至充分溶解，保温5 min后乳化，得到甘油三酯胶束。将6%的比例将甘油三酯胶束加入MRS培养基中，边加边搅拌，然后加入0.2%巯基乙酸钠，调pH值为6.0，121℃灭菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化

将五株乳杆菌按体积分数为1%的比例接种到灭完菌的MRS培养基中，37℃培养48 h，按相同的步骤再重复活化一次，备用。

1.4.2 菌株最适温度的测定

将活化好的菌株按1%的比例接种到MRS培养基中，分别在33，35，37，39，41，43 ℃下培养24 h，以未接种的MRS培养基作为对照，用分光光度计在600 nm处测量OD值。

1.4.3 菌株最适pH值的测定

配制好培养基后分别将pH值调至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，将5种菌按1%的量接种到调好pH值的MRS培养基中，在最适温度处培养24 h，以未接种的MRS培养基作为对照，用分光光度计在600 nm处测量OD值。

1.4.4 菌株生长曲线及产酸性能的测定

将活化好的菌株按1%的比例接种到MRS培养基中，最适温度下培养24 h，以未接种的MRS培养基作为对照，每隔2 h测量OD600值和pH值。

1.4.5 菌株对人工胃液的耐受能力

将质量分数0.2%的NaCl和0.35%胃蛋白酶加入烧杯中，用浓度为1 mol/L的HCL调整pH值为3.0后，使用0.22 μm的过滤器过滤除菌后备用。将活化好的菌种培养液离心，收集菌体，加入生理盐水，使用漩涡混合器制菌悬液后以1∶9的比例与人工胃液混合，最适温度下孵育3 h，以未孵育的菌种为对照，使用高层琼脂柱法计数，计算菌种存活率，即

1.4.6 菌株对胆盐的耐受能力

将不同浓度的猪胆盐加入到MRS培养基中，按1%的量接种后最适温度下培养48 h，以未加入胆盐的培养基作为对照，用分光光度计在600 nm处测量OD值。

1.4.7 菌株对TC的降解能力

将菌接种到胆固醇培养基后最适温度下培养48 h，每隔6个小时测定TC降解量，以不含TC为对照，将培养基在转速为5 000 r/min下离心10 min，用胆固醇试剂盒测定TC的量。

1.4.8 菌株对TG的降解能力

将菌接种到甘油三酯培养基后最适温度下培养48 h，每隔6个小时测定TG降解量，以不含TG为对照，将培养基5 000 r/min离心10 min，用甘油三酯试剂盒测定TG的量。

1.4.9 降脂机制的初步探究

将菌接种到胆盐高脂培养基培养48 h后取5 mL，转速为5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀用无水乙醇反复洗涤3次后溶于pH值为7的磷酸盐缓冲液，离心，测定上清液中TC和TG量A1。弃去此时上清液，加入无水乙醇超声破碎，离心后摇匀，测定细胞破碎液中TC和TG量A2。

2 结果与分析

2.1 乳杆菌基本特性的研究

2.1.1 菌株最适生长温度和pH值的测定

为了确定乳杆菌最适生长条件，以pH值、温度进行单因素实验，如图1和图2所示。

图1 最适pH值的测定

图2 最适生长温度的测定

由图1和图2可以看出，菌株在不同的pH值和温度下生长状况都不同。5种菌的最适pH值均为6.0，而LP的最适生长温度为33℃，其余菌为37℃。实验时采用最适条件培养乳杆菌。

2.1.2 菌株生长曲线及产酸能力的测定

在发酵产品中，乳杆菌利用葡萄糖或蔗糖产酸，使pH值下降。这不仅具有细菌学意义，而且能促进产品的干燥速度。为了了解菌株生长状况及产酸性能，每隔2个小时测量OD600值，绘制5株菌的生长曲线和产酸曲线，如图3和图4所示。

图3 生长曲线的测定

图4 产酸能力的测定

由图3和图4可以看出，随着时间的推移，菌株生长速率及产酸速率也不同，LC和LP生长速度较快，产酸能力也较强，20 h后，pH值已下降至3.81，之后OD值和pH值也变化很小，说明菌株生长已进入生长稳定期。

2.1.3 菌株耐酸及耐胆盐能力的测定

胃酸和胆汁盐具有抗菌性，乳杆菌被食入后菌体必须通过胃液，同时还要能够抵抗胆汁盐。固菌种对胃酸及胆盐的耐受性是衡量益生菌的重要指标[6]。对五株菌进行胃酸和胆盐耐受性测试，结果如表1所示。

表1 乳杆菌耐酸耐胆盐能力 %

由表1可以看出，5株菌均表现出了一定的益生功能，随着胆盐质量分数的增加，菌株存活率下降。在pH=3的人工胃液中，4种菌存活率均大于35%，其中，LGG和LA存活率分别为78.41%和66.02%；在胆盐质量分数为0.3%时，LC和LP存活率均大于30%；LC，LP和LGG在pH=3且胆盐质量分数为0.3%的MRS培养基中存活率分别为40.28%，44.11%，21.27%。

2.2 菌株降脂性能的测定

分别对5种菌进行体外胆固醇和甘油三酯降解实验，并测定不同质量分数的胆盐对菌株降解胆固醇的影响，结果如图5～图7所示。

由图5和图6可以看出，随着时间的增加，菌株对胆固醇和甘油三酯的降解量逐渐增加。LB，LC，LGG降解胆固醇效果较好，分别为45.63%，48.13%，30.63%；LC降解甘油三酯效果较好，为23.06%。其中，LC对胆固醇和甘油三酯的降解能力显著高于其他菌株，分别为45.60 mg/L和0.91 g/L。由图7可知，当加入不同质量分数胆盐后，由于胆盐的抑菌作用，4种菌对胆固醇的降解作用都显著下降，但LP对胆固醇的降解作用反而增强，降解率从23.12%增加至31.25%，可能由于LP将胆盐分解后，胆固醇合成胆盐，从而促进胆固醇的分解代谢，降低胆固醇质量浓度。

一般认为，能在pH=3的条件下存活2 h并能耐受0.1%胆盐的乳杆菌就能顺利通过胃和上段肠管到达下段肠管从而放大其生物学功效[7]。本研究将菌在pH=3的人工胃液孵育3 h，再在高脂培养基添加质量分数为0.3%胆盐，培养后测定各菌株降脂能力，结果如表2所示。

表2 人工胃液孵育后的降脂能力

由表2可以看出，在模拟人体内环境后，菌株对胆固醇和甘油三酯的降解能力表现出了明显的菌株特异性，其中，LC和LP的降脂性能较好，对胆固醇和甘油三脂的降解量分别为20.00，22.00 mg/L和0.86，0.12 g/L。

2.3 菌株降脂机制

关于益生菌降解胆固醇的机理，学者们提出了不同的假说，如胆盐的脱结合，共沉淀，吸收等，甘油三酯的降解机制可能与胆固醇类似，但在国内外相关报告较少[8-9]。本研究通过对可能发生的共沉淀和吸收机制的研究，初步探究乳杆菌的降脂机理，结果如表3所示。

表3 菌株降脂能力及共沉淀的测定

研究表明，当pH值低于5.5时，胆固醇会随着胆盐一起沉淀下来，而此沉淀溶于pH值为7的磷酸盐缓冲液。如表3所示，LB和LGG会使胆固醇和胆盐发生共沉淀，前者还能吸附部分胆固醇至细胞内，从而吸收利用胆固醇。在缓冲液中并没有发现甘油三酯，但在离心的菌体上清液中含有甘油三酯，说明LB和LC可能通过吸收或吸附的方式将甘油三酯利用。

3 结论

传统发酵食品是我国食品领域中的一个非常重要的组成部分，它因具有独特的色、香、味而深受人们的喜爱。功能性食品是新时代对传统食品深层次的要求。本研究从西北地区传统发酵果蔬和乳品中分离筛选出5株乳杆菌，针对其益生方面进行研究，加强发酵产品功能性。实验发现，5株菌都展现出较好的益生功能，对人工胃液均有一定的适应能力；通过降脂实验表明，不同菌株在降脂能力方面都表现出了菌株特异性，其降解机理上也表现出了菌株特异性，胆固醇降解效果最好的是LC，降解率为48.1%，最低是LA，降解率仅为4.8%，甘油三酯降解效果最好的是LC，降解率为23.06%，其余4株菌均低于5%；当胆盐质量分数增加，LP对胆固醇的降解作用反而增强，其余4株菌降解作用都下降，可能由于LP将胆盐分解后，胆固醇合成胆盐，从而增加了对胆固醇的利用率；目前国内外在乳杆菌利用甘油三酯方面的研究相对较少，本研究从甘油三酯降解机制上出发，发现乳杆菌在对甘油三酯的利用机制上可能与胆固醇利用机制类似，都是通过吸收或吸附方式，具体机制还有待进一步研究。

[1]李里特，李风娟，王卉，等.传统发酵食品的机遇和创新[J].农产品加工，2009,（8）：61-64.

[2]杜鹏，霍贵成.传统发酵食品及其营养保健功能[J].中国酿造，2004,23（3）：6-8.

[3]王笋，吕嘉枥，辛博，等.西北地区泡菜中乳酸杆菌的生物学特性[J].中国调味品，2014,39（3）：15-18.

[4]胡丽华，苏东海，苏东民.多菌种混合发酵对主食风味的影响[J].食品科技，2010,35（3）：149-152.

[5]赵胜娟，孙文峰，刘爱萍，等.益生菌对肠道微生态影响的研究现状[J].食品研究与开发，2008,29（4）：182-185.

[6]彭灯水，颜正财，汤春梅，等.泡菜优良发酵乳酸菌耐受特性研究[J].食品与发酵科技，2010,46（4）：50-55.

[7]MT LIONG,NP SHAH.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains[J].Journal of Dairy Science,2005,88（1）：55-66.

[8]解傲，袁杰利.双歧杆菌降胆固醇的作用机制[J].中国微生态学杂志，2014,26（4）：493-495.

[9]史力群，卢放根，崔熠，等.双歧杆菌及乳酸杆菌在肥胖大鼠肠道中的动力学[J].世界华人消化杂志，2010,18（35）：3732-3739.