HPLC-ICP-MS法测定农田土壤中甲基汞和乙基汞*

宋志峰，陈冠宁，魏春雁，樊慧梅，刘笑笑

(1.吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所／农业部农产品质量安全风险评估实验室，长春 130033；2.吉林省中医药科学院，长春 130021)

土壤中的汞主要以元素汞(Hg)、无机汞离子化合物(Hg+，Hg2+)、有机汞(MeHg+和EtHg2+)等形态存在。农田土壤中汞除了自然本底以外，另外一个重要来源是含汞及有机汞的农药、杀菌剂或者种子处理剂等的大量使用。汞的形态不同其毒性也各不相同，有机汞的毒性比无机汞强，尤以甲基汞的毒性最强，乙基汞次之，且甲基汞和乙基汞容易被生物体吸收，并通过食物链的富集最终进入人体，其代谢周期长，即使剂量很少也能积累致毒。近些年，随着重金属形态研究的不断发展，人们已经认识到只进行重金属的总量检测与评估意义并不大，只有对重金属的形态和总量同时进行分析才能正确评价重金属的污染程度及潜在风险，才能制定出科学合理的预防和治理措施，实现农业的可持续发展。

汞形态分析的前处理方法有汞化合物的萃取富集方法［1-8］和衍生化方法［9-10］等；测定方法主要有光谱法［11］、毛细管泳法(CE)［12］、气相色谱法(GC)［13］、高效液相色谱法(HPLC)［14］及联用技术(GC-AFS，GC-AAS，CE-AFS，GC-MS，GC-ICPTOFMS，HPLC-ICP-MS和HPLC-AFS等)［4，15-19］。其中联用技术由于具有较高的分离能力和灵敏度而成为汞形态分析中的主要技术。以往报道的方法中存在最大的问题是样品处理过于繁琐，使用GC方法分离时往往需要衍生；HPLC分析要经过反复萃取与反萃取，测定难度较大并容易引入人为误差。笔者经过大量试验，建立了超声波辅助的硝酸溶液萃取、HPLC-ICP-MS联用测定农田土壤中甲基汞和乙基汞的方法。实验结果表明，本方法具有样品处理简单、重现性好、检出限低、准确度高等特点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电感耦合等离子体质谱仪：7500Cx型，美国Agilent科技有限公司；

高效液相色谱仪：1100型，美国Agilent科技有限公司；

分析天平：(1)BT124S型，感量为0.000 1 g，德国Sartorius公司，(2)DL202-L型，感量为0.001 g，梅特勒-托利多上海有限公司；

离心机：DL-6000B型，转速为4 000 r／min，上海安亭科学仪器厂；

超声波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司；

L-半胱氨酸盐酸盐、β-巯基乙醇：分析纯；

硝酸：优级纯，体积分数为38%；

2%硝酸溶液：量取38%硝酸1 mL与18 mL水混合；

氨水：体积分数为28 %～29 %；

甲醇：色谱纯；

氯化甲基汞标准品：CAS 115-09-3，纯度大于98.5%，中国计量科学研究院；

氯化乙基汞标准品：CAS 107-27-7，纯度大于98.0%，中国计量科学研究院；

质谱调谐液：推荐选用含有钴(Co)、钇(Y)、铊(Tl)元素的质谱调谐液，调谐液浓度为仪器生产商推荐浓度，介质为2%硝酸溶液；

甲基汞、乙基汞混合标准储备液：质量浓度均为1 000 mg／L。准确称取氯化甲基汞、氯化乙基汞标准品各1 000.0 mg，用2%硝酸溶液溶解并定容至1 000 mL，于0～4℃冰箱中储存，有效期为3个月；

甲基汞、乙基汞混合标准溶液：质量浓度均为0.1 mg／L。吸取适当体积的氯化甲基汞、氯化乙基汞标准储备液，用水逐级稀释，于0～4℃冰箱中储存，有效期为1个月；

甲基汞、乙基汞系列混合标准工作溶液：用移液管分别移取混合标准溶液0，0.10，0.50，5.0，25，50.0 mL于6只100 mL容量瓶中，用水稀释至标线，混匀。两种有机汞质量浓度均为0，0.000 1，0.000 5，0.005，0.025，0.050 μg／mL，现用现配；

土壤样品：采自吉林省磐石市、蛟河市、辉南县、桦甸市和抚松县5个地区的玉米大田；

除另有说明外，实验用其它试剂均为分析纯；

实验用水符合GB／T 6682中一级水的要求；

实验所用的玻璃器皿均需用20%硝酸浸泡12 h以上，用水反复冲洗干净。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 HPLC条件

色谱柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；柱温：25℃；流动相：5 mmol／L乙酸铵与3.8 mmol／L L-半胱氨酸盐酸盐混合溶液-甲醇(95∶5)［先加入适量浓氨水，再用氨水溶液(10∶90)调pH至7.5，流动相现用现配，使用时间不超过24 h］；流量：1.0 mL／min；进样体积：100 μL；色谱分离中需保证甲基汞、乙基汞的分离度不小于2.0。

1.2.2 ICP-MS条件

使用玻璃同心雾化器；石英雾化室、矩管；Ni采样锥、截取锥；采样模式：Time program；同位素：202Hg积分时间：0.5 s。在无碰撞气模式下，使用质谱调谐液对仪器工作状态进行优化，调谐参数见表1，优化后的状态指标见表2。

表1 电感耦合等离子体质谱仪调谐参数

表2 电感耦合等离子体质谱仪调谐指标

1.3 样品处理

选取具有代表性的农田土壤样品(不少于500 g)，混匀后用四分法缩分至约100 g，风干，除去样品中石块和动植物残体等异物，用玛瑙研钵研磨，全部通过0.150 mm尼龙筛。

称取制备的试样约5.0 g(精确至0.01 g)于离心管中，缓慢加入0.5 mol／L硝酸溶液20 mL，边加边搅拌至不产生气泡为止，超声提取1.0 h，以4 000 r／min离心5 min，吸取上层澄清溶液5.00 mL于25 mL烧杯中，用氨水溶液(10∶90)调pH值到7.5，转移至25 mL容量瓶中，加水定容至标线，摇匀，过0.45 μm滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相考察

对L-半胱氨酸盐酸盐和巯基乙醇两种流动相体系进行了考察。结果发现使用巯基乙醇甲基汞和乙基汞的保留时间明显缩短，可节省分析时间。但是灵敏度和重现性与L-半胱氨酸盐酸盐流动相体系相比较差，综合考虑，使用L-半胱氨酸盐酸盐流动相体系。流动相pH对两种有机汞的峰形有一定影响，当体系偏酸性时，峰高变小；当pH＞7.0时，峰高增大，有助于提高分析灵敏度。经试验对比，确定流动相pH为7.5。流动相中甲醇的比例增加时，有助于两种有机汞的洗脱，但随着甲醇比例的增加，造成碳在采样锥上的累积，不但使灵敏度降低还容易使ICP-MS熄火。在分析时间可接受的情况下，选择甲醇的比例为5%。按1.2仪器工作条件，对甲基汞和乙基汞的标准溶液进行分析，总离子流图见图1。由图1可知，两种有机汞得到良好分离。

图1 甲基汞、乙基汞标准物质总离子流图

2.2 样品前处理方法

2.2.1 提取溶剂

在空白样品中加入适当浓度的甲基汞、乙基汞标准溶液，使最终测定液中甲基汞、乙基汞的质量浓度分别为10，6.47 ng／mL。分别以0.1，0.5，1，2，6 mol／L的HCl和HNO3溶液为甲基汞和乙基汞的提取溶剂进行试验，发现HCl和HNO3溶液的提取效率相当。考虑到HNO3溶液的基体效应较小，因此选择HNO3溶液为提取溶剂。当HNO3溶液的浓度达到0.5 mol／L后，提取率不再增加，因此选择HNO3提取剂的浓度为0.5 mol／L。

2.2.2 提取方式

在空白样品中加入适当浓度的甲基汞、乙基汞标准溶液，使最终测定液中甲基汞、乙基汞的质量浓度分别为10，6.47 ng／mL。使用0.5 mol／L HNO3溶液为提取溶剂，比较了室温振荡提取1，2，3，4，5 h和超声波提取0.5，1，1.5，2 h时甲基汞和乙基汞的提取效率。试验发现室温振荡提取4 h和超声波提取1 h的提取效率均达到最大且效率相当，因此采用超声提取1 h的方式。

2.3 样品提取液稳定性

在空白样品中加入适当浓度的甲基汞、乙基汞标准溶液，使最终测定液中甲基汞、乙基汞的质量浓度分别为10，6.47 ng／mL，按1.3方法处理样品，分别于0，6，12，24，48 h对提取液进行分析，样品溶液稳定性测定结果见表3。由表3可知，甲基汞、乙基汞提取液在24 h内稳定。

表3 土壤样品甲基汞、乙基汞提取液稳定性测定结果

2.4 方法线性和检出限

将甲基汞、乙基汞系列混合标准工作液按1.3方法进行处理后上机测定，以两种有机汞的响应值Y (CPS)为纵坐标、质量浓度X (ng／mL)为横坐标进行线性回归，得到回归方程。以信噪比S／N=3计算检出限。两种有机汞的线性方程、线性范围、相关系数和检出限见表4。

表4 甲基汞、乙基汞的线性方程、相关系数和检出限

2.5 精密度和回收试验

称取空白样品12份，按表5所示量加入甲基汞和乙基汞，每个水平进行3次平行测定，计算样品回收率和相对标准偏差，结果见表5。由表5可知，甲基汞、乙基汞的回收率分别为89.26%～94.26%，76.88%～79.27%，测定结果的相对标准偏差分别为1.67%～2.38%,2.58%～3.84%，说明该方法准确度较高，方法稳定可靠。

表5 加标回收和精密度试验结果(n=5)

2.6 样品测定

对采自吉林省磐石市、蛟河市、辉南县、桦甸市和抚松县的5份玉米大田土壤样品进行了甲基汞和乙基汞的测定，结果见表6。

表6 玉米大田土壤中甲基汞、乙基汞的测定结果 μg／kg

3 结语

建立的HPLC与ICP-MS联用测定农田土壤中的甲基汞和乙基汞的方法，样品处理简单快速、检出限低，精密度、准确度符合准确定量的要求。该法适合于农田土壤中甲基汞和乙基汞的测定。

［1］Westöö G. Determination of methylmercury compounds in foodstuffs.I.Methylmercury compounds in fish，identification and determination［J］. Acta Chem Scand，1966，20(8): 2 131-2 137.

［2］江桂斌，顾晓梅，倪哲明，等.毛细管气相色谱-原子吸收法测定生物样品中的有机汞化合物［J］.色谱，1991，9(6): 350-352.

［3］Krishna M V B，Ranjit M，Karunasagr D，et al. A rapid ultrasoundassisted thiourea extraction method for the determination of inorganic and mercury in biological and environmental samples by CVAAS［J］. Talanta，2005，67(1): 70-81.

［4］Nevado J J B，Martin-Doimeadios R C R，Berardo F J G，et al. Determination of mercury species in fish reference materials by gas chromatography-atomic fluorescence detection after closed vessel microwave-assisted extraction［J］. J Chromatogr A，2005，1 093(1-2): 21-28.

［5］Houserova P，Matejicek d，Kuban V. High-performance liquid chromatography／iorr-trap mass spectrometric speciation of aquatic mercury as its pyrrolidinedithiocarbamate complexes［J］. Anal Chim Acta，2007，596(2): 242-250.

［6］Mishra S，Tripathi R M，Bhalke S，et al. Determination methylmercury and mercury(Ⅱ)in a marine ecosystem using solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry［J］. Anal Chim Acta，2005，551(1-2): 192-198.

［7］Gil S，Fragueiro S，Lavilia I，et al. Determination of methylmercury by eletrothermal atomic absorption spectrometry using headspace single-drop micoextraction with in situ hydride generation［J］.Spectrochim Acta (Part B)，2005，60(1): 145-150.

［8］Pvelaa N，Caruso J A. Element selective detection for supercriticalfluid chromatography［J］. J Biochem Biophys Methods，2000，43(1-3): 45-58.

［9］Bravo-Sanchezl R，Encinar J R，Martinezj I F，et al. Mercury speciation analysis in sea water by solid phase microextractiongas chromatograph-inductively coupled plasma mass spectrometry using ethyl and propyl derivatization.Matrix effects evaluation［J］.Spectrochim Acta(Part B)，2004，59(1): 59-66.

［10］Gomez-Ariz J L，Lorenzo F，Garcia-Barrera T，et al. Analytical approach for routine methylmercury determination in seafood using gas chromatography-atomic fluorescence spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2004，551(1): 165-173.

［11］祁辉，刘爱民，黄业茹，等.巯基棉富集-毛细管气相色谱法测定环境水中的甲基汞［J］.中国环境监测，2010，26(4): 33-36.

［12］Medina I，RubíE，Mejuto M C，et al. Speciation of organomercurials in marine samples using capillary electrophoresis［J］. Talanta，1993，40(11): 1 631-1 636.

［13］王喜梅，连宁.巯基棉富集气相色谱法测定水中微量甲基汞［J］.青海环境，1999，9(4): 151-159.

［14］殷学锋，徐青.汞的形态分析研究(2)固相萃取预富集-液相色谱分离测定图通形态的汞［J］.分析化学，1995，23(11): 1 305-1 307.

［15］梁淑轩，庞秀言，孙汉文.超短柱气相色谱与原子吸收联用技术的优化及其在甲基汞形态分析中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2002，12(3): 262-263.

［16］Chen S S，Chou S S，Hwang D F. Determination of methylmercury in fish using focused microwave digestion following by Cu2+addition，sodium tetrapropylborate derivatization，n-heptane extraction，and gas chromatography-mass spectrometry［J］. J chromatogr.A，2004，1 024(1-2): 209-215.

［17］Jitaru P，Adams F C. Speciation analysis of mercury by solidphase microextraction and multicapillary gas chromatography hyphenated to inductively coupled plasma-time-of-flight-mass spectrometry［J］. J Chromatogr A，2004，1 055(1-2): 197-207.

［18］Wang M，Feng W Y，Shi J W，et al. Development of a mild mercaptoethanol extraction method for determination of mercury species in biological samples by HPLC-ICP-MS［J］. Talanta，2007，71(5): 2 034-2 039.

［19］Liang N，Jiang G B，Liu J F，et al. Speciation analysis of mercury in seafood by using high-performance liquid chromatography online coupled with cold-vapor atomic fluorescence spectrometry via a post column microwave digestion［J］. Anal Chim Acta，2003，477(1): 131-137.