二烯丙基二硫下调β-catenin抑制人胃癌MGC803细胞EMT

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(1.怀化市第一人民医院，湖南 怀化 418000；2.湖南省胃癌研究中心，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

二烯丙基二硫下调β-catenin抑制人胃癌MGC803细胞EMT

向姝霖1,2#，刘芳2#，夏红2，曾希2，苏波2，董琳2，凌晖2，苏琦2*

(1.怀化市第一人民医院，湖南 怀化 418000；2.湖南省胃癌研究中心，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001)

目的研究二烯丙基二硫(DADS)抑制人胃癌MGC803细胞EMT与形态学变化。方法应用相差显微镜与透射电镜观察30 mg·L-1DADS处理后的MGC803细胞形态学与超微结构的变化。RT-PCR与Western blot检测β-catenin和EMT标记E-cadherin与Vimentin表达。结果30 mg·L-1DADS处理MGC803细胞24 h后，相差显微镜显示，与未处理比较，细胞圆形、椭圆形，核浆比值降低，巢状分布，均未见伪足。透射电镜显示，细胞表面微绒毛数目减少，细胞核变规整，核浆比值下降，异型性降低，细胞与细胞之间出现连接结构，细胞器增多。RT-PCR与Western blot表明，DADS可呈时间依赖性分别下调MGC803细胞β-catenin和Vimentin mRNA与蛋白和上调E-cadherin mRNA与蛋白。结论DADS可通过下调β-catenin上调E-cadherin与下调Vimentin抑制EMT和伪足形成。

二烯丙基二硫； 人胃癌MGC803细胞； EMT； β-catenin； E-cadherin； Vimentin

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。据最新统计，胃癌的发生率与死亡率分别为全球第四位与第二位，每年新发病例约95.16万，死亡约72.31万。由于患者就诊时大多已经发生侵袭转移，从而疗效差，中位生存期不超过10个月，5年生存率低于10%，严重威害人类的生命健康[1,2]。因此，开发有效的抗肿瘤药物，对治疗胃癌具有重要意义。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的脂溶性有效成分，可抑制多种肿瘤细胞增殖，其机制与调节生物酶降低化学致癌物毒性，抑制DNA加合物形成，阻滞肿瘤细胞周期演进，诱导肿瘤细胞分化和调亡，组蛋白修饰，抑制血管形成与侵袭等有关[3]。我们已经证明，DADS可体内外明显抑制人胃癌细胞增殖，与激活p38，抑制ERK，调节ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1等相关分子，上调组蛋白乙酰化和p21WAF1表达，阻滞G2/M期，上调miR-200b与 miR-22等有关[4-8]。并且，可通过下调LIMK1、p-Cofilin1、MMP-9和上调TIMP-3抑制人胃癌细胞迁移与侵袭[9-11]。本研究观察DADS对人胃癌细胞EMT与形态学的影响，探讨抑制迁移与侵袭的机制。

1 材料和方法

1.1试剂DADS：Fluka公司产品，纯度80%，与Tween80以1∶2比例充分溶解，加入体积分数为0.90的生理盐水稀释100倍，作为母液保存于-20 ℃冰箱。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT试剂盒(Invitrogen 公司)，PCR试剂(Promega公司)，BCA蛋白定量检测试剂盒(Pierce公司)，ECL发光检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，β-catenin、E-cadherin，Vimentin与β-actin抗体购自美国Abcam公司。

1.2细胞培养人胃癌MGC803细胞系南华大学肿瘤研究所保存。在含10%小牛血清的RPMI-1640(GIBCO，USA)培养液培养于370C，含5%CO2，恒湿、恒温培养箱中培养。细胞呈单层生长，铺满培养瓶后传代，传代时常规吸去培养液，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化3 min，倾去胰酶，加适量含血清培养液吹打成单细胞悬液，按所需浓度接种。

1.3相差显微镜检查30 mg· L-1DADS处理MGC803细胞24 h，倒置相差显微镜观察处理前后细胞形态学变化。

1.4透射电子显微镜检查取对数生长期的MGC803细胞，常规胰酶消化传代，接种于24孔培养板培养6 h，待细胞贴壁后，处理组加30 mg· L-1DADS，阳性对照用2.0%DMSO(Sigma,USA)，阴性对照为常规培养液，分别处理24 h。消化收集细胞，离心，PBS液洗两次，2.5%戊二醛/PBS固定24 h，剔取细胞团，PBS清洗3次×10 min；1%锇酸后固定1 h，PBS清洗3次×10 min；50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水，各10 min；环氧树脂(Epon 812)浸泡24 h，包埋成块24 h；LKB-Ⅲ型超薄切片机切成500-700A0超薄切片，硝酸铅、醋酸铀双重染色，H-600日产透射电子显微镜下观察、摄片。

1.3 RT-PCR Total RNA Kit 提取细胞总RNA，在 AMV 酶作用下逆转录合成cDNA。设计并合成PCR扩增引物。E-cadherin：F 5′-CTCCCAATACATCTCCCTTCAC-3′,R 5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAGTAA-3′,扩增片段423 bp;Vimentin：F 5′-GCGAGG AGAGCAGGATTTC-3′,R 5′-TCTTGTAGGAGTGTCGGTTGTT-3′,扩增片段351 bp;β-catenin:F 5′-GGAAGGGACAGTATCGTTTGTT-3′,R 5′-GCCTCAGCATCTACCA GCATAG-3′,扩增片段334 bp;β-actin：F 5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′,R 5′-AAGGAAGGATGGAAGAGTG-3′,扩增片段564 bp。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，BIO-RAD凝胶成像系统拍照，AlphaImager 2200软件扫描，计算平均光密度值。

1.4 Western Blot 收集细胞，冰PBS洗两次，1×107个细胞加入100 μL裂解液(100 mM NaCl，10 mM Tris-Hcl pH 7.6，1 mM EDTA pH 8.0，1 μg·mL-1Aprotinin，100μg·mL-1PMSF)，冰上裂解1 h，12 000 r/min离心10 min，吸出上清液，即细胞总蛋白。Bradford法测定蛋白含量，分光光度计在570 nm波长处测定光吸收值，以溶剂为空白对照，牛血清白蛋白为标准绘制曲线，依据标准曲线推算蛋白含量。使蛋白变性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L 含0.1% Tween-20)封闭1h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定光密度值。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计学软件One-Way Anova或t检验进行统计学处理，P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 MGC803细胞形态学改变相差显微镜显示，未处理组MGC803细胞排列松散、弥漫分布，呈长梭形，核大而核浆比值大，胞浆伸出形成纤细伪足，有的细胞具有多个伪足，甚至形成网状。30 mg· L-1DADS处理24h后，细胞聚集，呈巢状，细胞圆形、椭圆形，少数细胞呈胖梭形，核浆比值降低，胞浆增多，均未见伪足(图1)。

图1 DADS 处理MGC803 的形态学变化(×40) A:非处理组;B: DADS处理组

2.2 MGC803细胞超微结构改变图2显示，MGC803细胞形状不规则，细胞表面有较多或丰富的微绒毛结构，胞浆较少，核大，核浆比值大，细胞核不规则，有切迹，畸形，有大而致密核仁，部分细胞有多个小核仁。细胞浆内，线粒体较少，形状不规则，线粒体嵴的数量少，常见空泡。粗面内质网不发达，数量少。细胞内多聚核糖体较多而游离核糖体少见。图3显示，30 mg· L-1DADS处理24 h后，MGC803细胞表面微绒毛减少，胞浆增多，核浆比值下降，核圆型，较规整，畸形少见，核仁致密或出现核仁内空泡，部分细胞核呈现退行性变；细胞有形成腺腔趋势，并出现细胞间连接结构；细胞器丰富，线粒体增多，伴有水肿，可见线粒体嵴；除粗面内质网外，有的出现滑面内质网，内质网有扩张、水肿和空泡变性；在胞浆内有成熟的分泌颗粒和脂滴，夹杂单核糖体和多聚核糖体，表明DADS可部分诱导MGC803细胞分化。图4显示DMSO处理后细胞的改变与DADS作用相类似。

图2 非处理组MGC803 细胞超微结构 A：表面有丰富的微绒毛，核浆比值大，核不规则，畸形，有致密核仁(5000×)；B：微绒毛丰富，核大，细胞器稀少(8000×)；C：大而致密核仁，出现空泡，细胞器稀少(10000×)

图3 DADS处理的MGC803细胞超微结构变化 A：表面微绒毛减少，核形状较规则，核浆比值变小，细胞器丰富增多(5000×)；B：细胞有形成腺腔趋势，并且出现细胞间连接结构(8000×)；C：可见线粒体嵴、内质网及核糖体(10000×)

图4 DMSO处理 MGC803 细胞的超微结构变化 A：表面有丰富的微绒毛，核浆比值大，核不规则，畸形，有致密核仁(5000×)；B：微绒毛丰富，核大，细胞器稀少(8000×)；C：大而致密核仁，出现空泡，细胞器稀少(10000×)

2.3 DADS对E-cadherin表达的影响图5与6显示，30 mg· L-1DADS处理MGC803细胞12 h、24 h、48 h后，DADS呈时间依赖性上调MGC803细胞E-cadherin mRNA和蛋白表达 (P<0.05)。

图5 E-cadherin mRNA表达 M:mark;1:Control;2:12 h;3:24 h;4:48 h. *：P<0.05 vs Control, #：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

2.4 DADS对Vimentin表达的影响图7与8显示，30 mg· L-1DADS处理MGC803细胞12 h、24 h、48 h后，与对照组相比，DADS可呈时间依赖性下调MGC803细胞Vimentin mRNA和蛋白表达 (P<0.05)。

2.5 DADS对β-catenin表达的影响图9与10显示，30 mg· L-1DADS分别处理MGC803细胞12 h、24 h、48 h后，与对照组相比，DADS可呈时间依赖性下调MGC803细胞β-catenin mRNA和蛋白表达 (P<0.05)。

图6 E-cadherin蛋白表达 1:Control; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 48 h. *:P<0.05 vs Control, #:P<0.05 vs 12 h,$:P<0.05 vs 24 h

图7 Vimentin mRNA表达 M: mark;1: Control;2: 12 h;3: 24 h;4: 48 h. *：P<0.05 vs Control, #：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

图8 Vimentin蛋白表达 1:Control;2: 12 h;3: 24 h;4: 48 h.*：P<0.05 vs Control,#：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

图9 β-catenin mRNA 表达 M:mark;1:Control;2:12 h;3:24 h;4:48 h. *：P<0.05 vs Control, #：P<0.05 vs 12 h,$：P<0.05 vs 24 h

3 讨 论

在肿瘤生长和演进过程中，上皮来源性肿瘤细胞发生上皮-间质转变(EMT)。EMT在多种因子的调节下，上皮细胞黏附分子E-cadherin下调和间质标记Vimentin上调，导致肿瘤细胞失去原有的紧密连接及粘附力，细胞形态从多边形变为梭形，从而获得侵袭与转移能力[12]。研究证实，Wnt/β-catenin通路与EMT 密切相关。β-catenin直接影响着Wnt通路的开放或关闭，当胞外Wnt增加时，Wnt与Frizzled结合，激活Dsh/Dvl蛋白，进而抑制GSK3Bβ/APC/Axin复合物对β-catenin的磷酸化，保护其不被降解，导致细胞内β-catenin增多，而进入胞核与转录因子Tcf/Lef结合，引起c-Myc、Cyclin D1、survivin、c-jun、Fra等靶基因转录，促进肿瘤增殖、血管形成、迁移侵袭和转移[13,14]。因此，β-catenin在促进EMT起着关键作用，而靶向抑制β-catenin可逆转EMT[14]。此外，E-cadherin 缺失是促进EMT的主要因子，E-cadherin/β-catenin 复合物和Wnt/β-caternin通路失调将导致β-catenin 核转位和EMT与促进靶基因激活[15]。

图10 β-catenin蛋白表达 1:Control;2:12 h;3:24 h;4:48 h.*:P<0.05 vs Control,#:P<0.05 vs 12 h,$:P<0.05 vs 24 h

Huang 等发现，DADS可明显通过抑制β-catenin活化下调Bcl-2和上调Bax，下调MMP-9和逆转EMT[14]。我们先前证明，DADS可体内外通过上调miR-200b与miR-22下调Wnt1、β-catenin和TCF-4 mRNA与蛋白表达，抑制人胃癌细胞增殖与移植瘤生长和诱导凋亡[8]。本研究结果表明，DADS处理后，MGC803细胞从弥漫分布，长梭形，核大而核浆比值大，转变为巢状分布，呈圆形、椭圆形，核浆比值降低。超微结构显示细胞核质比明显下降，细胞与细胞之间出现连接结构，细胞器数目增多，可见游离核糖体，表明DADS可降低胃癌细胞异型性，细胞形态可从梭形转变为圆形、椭圆形，具有逆转EMT作用。RT-PCR与Western blot进一步证明，DADS可呈时间依赖性下调MGC803细胞β-catenin与Vimentin和上调E-cadherin，提示DADS可能通过下调β-catenin上调E-cadherin与下调Vimentin，抑制EMT形成。

近年来，越来越多的研究认为，伪足形成是肿瘤转移中局部侵袭的重要驱动器，与EMT相关，伪足形成与EMT是恶性肿瘤细胞基本特征。EMT 通过溶解上皮细胞间粘附、调节细胞与基质粘附和诱导分泌ECM 降解蛋白酶导致上皮细胞的迁移与侵袭能力增加。因此，EMT可引发伪足或侵袭性伪足样结构形成。侵袭性伪足是具有丰富的actin与磷酸酪氨酸和高度降解ECM能力的膜突出，其可聚集MMPs降解ECM，在肿瘤侵袭转移中起着重要作用。已经鉴定大量蛋白，如EGF、HGF、PDGF与TGFβ等各种生长因子对侵袭性伪足与EMT形成是重要的。这些生长因子可活化非受体Src，而Src 具有诱导侵袭性伪足与EMT 的能力。最近，有人提出肿瘤细胞的伪足形成与actin细胞骨架重组对EMT和转移相关的新观点，但是，EMT与伪足形成的直接联系尚待确定，如果这些关系能够得到证实，那么将对阻止肿瘤细胞侵袭与转移的创新性治疗方法的研发带来曙光。因此，进一步研究这些问题是亟待解决的[16-18]。

目前，抑制侵袭性伪足形成与EMT已成为临床治疗的靶点。研究显示，调控EMT的重要因子Twist通过上调PDGFR表达与活性促进侵袭性伪足形成[17]。A431-Ⅲ 细胞是具有高迁移侵袭能力、MMP-9高表达与EMT增强的鳞癌A431细胞亚型，并且，其侵袭性伪足形成和降解ECM的能力增加。黄酮类化合物的有效成分Luteolin与Quercetin不仅可抑制A431-Ⅲ 细胞EMT，而且可废除侵袭性伪足形成、降低ECM降解与下调MMP-9，从而减少转移[18]。miR-21的小分子抑制剂AC1MMYR2与紫杉醇联合治疗可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞和恶性胶质瘤U87VⅢ细胞的迁移侵袭能力，减少高剂量紫杉醇诱导的侵袭性伪足形成，下调β-catenin与vimentin和上调E-cadherin，明显抑制EMT和减少肺转移[19]。FHOD1可促进梭形形态与F-actin形成和迁移侵袭，沉默FHOD1可减少EMT肿瘤细胞形成侵袭性伪足与降解ECM的能力[20]。

本研究发现，DADS作用MGC803细胞后，未见伪足形成，超微结构显示微绒毛减少，表明DADS可抑制人胃癌细胞伪足形成。LIMK1表达或活性增强可导致磷酸化cofilin1水平升高，增加肌动蛋白聚合，促进细胞伪足形成，驱动肿瘤细胞迁移侵袭，而DADS可阻断Rac1-Pak1/Rock1通路下调LIMK1，抑制cofilin1磷酸化，从而抑制人胃癌细胞迁移与侵袭，提示DADS可能通过下调LIMK1抑制cofilin1磷酸化，降低actin聚合，抑制伪足形成[9-11]。

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DADSInhibitEMTThroughDown-Regulationofβ-catenininHumanGastricCancerMGC803Cells

XIANG Shulin,LIU Fang,XIA Hong,et al

(TheHuaihuaFirsthospital,Huaihua418000Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the effect of EMT and morphology change in human gastric cancer MGC803 cells induced by diallyl disulfide (DADS).MethodsThe phase contrast microscope and transmission electron microscope were employed to confirm the DADS-induced morphology change.The expression of β-catenin,E-cadherin and Vimentin was detected by RT-PCR and Western blot in MGC803 cells after treated by 30 mg·L-1DADS.ResultsThe phase contrast microscope show that MGC803 cells after 24 h treated by 30 mg·L-1DADS were round or ellipse,enlarged cytoplasm,descend nuclear/cytoplasmic ratio,exhibited nest and even not view pseudopodia.Transmission electron microscope results show,that the number of microvilli on cells surface decrease,malignance declining as cellular heteromorphism diminish,nucleocytoplasmic proportion reduce,intercellular conjunctional structure appear and cellular organ increase in cytoplasm after MGC803 cells treated by DADS to contrast untreated.RT-PCR and Western blot indicated that DADS may be down-regulation of β-catenin and Vimentin mRNA and protein up-regulation of E-cadherin mRNA and protein in time dependence in MGC803 cells.ConclusionAll these suggested that DADS may inhibit EMT and pseudopodia via down-regulation of β-catenin to up-regulate E-cadherin and down-regulate Vimentin in MGC803 cells.

diallyl disulfide; human gastric cancer MGC803 cells; EMT; β-catenin; E-cadherin; Vimentin

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.002

2015-07-30；

2015-09-02

国家自然科学基金(81102854,31100935，81374013)；湖南省卫计委科研项目(B2015-182).

*通讯作者，E-mail:suqi1945@163.com.

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A

(此文编辑：秦旭平)