基于叶酸受体介导的磁性荧光靶向纳米探针的制备及其性能研究

李永敏，沈 茂

（台州学院实验室与设备管理处，浙江 临海 317000）

基于叶酸受体介导的磁性荧光靶向纳米探针的制备及其性能研究

李永敏，沈 茂

（台州学院实验室与设备管理处，浙江 临海 317000）

拟采用一步溶剂热法先制备出带有无定型碳层包覆的磁性Fe3O4纳米粒子；然后通过静电结合法，将巯基丙酸修饰的水溶性CdTe量子点组装到其表面；为了使所制备的磁性探针具有较好的稳定性和生物相容性，通过Stober法在纳米粒子最外层包裹上生物相容性和结构稳定的带有胺基修饰的二氧化硅壳层；最后与叶酸(FA)进行耦合，制得具有磁性和荧光的双功能靶向纳米探针。分别利用荧光光谱，傅里叶变换红外光谱（FTIR），X射线衍射（XRD），扫描电镜（SEM），透射电子显微镜（TEM）和振动样品磁强计（VSM）等对所制备的磁性荧光复合纳米粒子的形态、大小、化学成分及磁性能进行表征。实验结果表明：所得产物粒径大小约200 nm，磁化强度约21.9 emu·g-1，仍然保持有较强的荧光性能，在生物成像方面具有潜在的应用价值。

叶酸；CdTe量子点；Fe3O4纳米颗粒；溶剂热；荧光

近几年来，功能纳米生物材料以其多样性和特殊性正越来越多地引起各国研究者的关注。其中，半导体荧光量子点作为一种由II-VI 族(CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, HgSe)或III-V族(InP, InAs)元素组成的纳米颗粒，可以简单地通过改变粒径尺寸大小来调节其荧光发射峰的波长，从而获得连续的激发光谱。同时，与传统的有机荧光染料不同，量子点的激发光谱宽，同一种类不同尺寸大小的量子点可以由单一波长的光源激发。而且，半导体荧光量子点还具有高量子产率、较窄的发射光谱半高宽及较强的抗光漂白性等一系列优异的光学特性。因此，将量子点作为荧光标记物已成为近年来国内外的研究热点，已有不少文献报道量子点被成功应用于细胞标记、免疫荧光检测和活体成像[1-5]。另一方面，以四氧化三铁为代表的磁性纳米材料由于具有超顺磁性和高饱和磁化强度，在生物医用诊断、治疗等领域具有重要的研究价值[6-8]。经过表面修饰后的磁性纳米颗粒能与特定的细胞、蛋白、DNA等发生偶联，通过外加磁场作用即可实现对这些特定的生物分子的分离和标定[9-11]。

然而，单一功能化的纳米材料在实际应用中不可避免地会受到一定限制。如果将量子点和磁性纳米颗粒复合，就可以同时完成对特定生物分子的荧光标记和磁性分离。而且，具荧光可示踪性、磁响应性和表面功能性的荧光双重功能的纳米材料，在靶向药物载体、细胞的分离和标识、磁共振成像以及生物传感器等众多领域具有广阔的应用前景[12-15]。

受体介导的肿瘤靶向成像就是以肿瘤细胞表面特异性或过度表达的受体为靶点，以受体对应的配体或配体结合物为载体，利用受体和配体的特异性反应，将靶向探针递送至受体表达阳性肿瘤细胞的一种成像系统。探针既可以是放射性核素，也可以是荧光物质，该成像技术可增强探针的选择性，成为肿瘤生物标记的研究热点。作为介导细胞内化的特异性受体之一，叶酸受体（FR）能够将叶酸及其复合物摄取入真核细胞胞浆由于FR在部分人体肿瘤如卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、鼻咽癌和肾细胞癌等细胞表面都有过量表达，而在正常组织的表达又高度保守，因此利用FR进行肿瘤特异性显像和治疗也受到广泛关注[16]。

本研究拟采用一步溶剂热法，先制备出无定型碳包覆的磁性 Fe3O4纳米粒子；然后通过静电吸附法，将巯基丙酸修饰的 CdTe荧光纳米粒子组装到其表面；为了使所制备的探针具有较好的稳定性和生物相容性，通过Stober法在磁性纳米粒子最外层包裹上生物相容性和结构稳定的胺基修饰的二氧化硅壳层；最后再与叶酸(FA)进行耦合，制得具有磁性和荧光的双功能靶向复合纳米探针, 其制备示意图如图1所示。

图1 叶酸受体介导的磁性荧光靶向纳米探针的制备示意图Fig. 1 The preparation procedure of the Fe3O4@C-CdTe@SiO2-FA microspheres

1 实验部分

1.1 实验药品及仪器

二茂铁，二氧化碲（TeO2），CdCl2•2H2O，巯基丙酸（MPA），正硅酸乙酯（TEOS）等化学试剂均为分析纯，购自上海润捷化学试剂有限公司；叶酸（FA）购自上海惠兴生化试剂有限公司；傅里叶变换红外光谱（Nicolet，美国热电公司），X射线衍射（Dmax-2500，Rigaku公司），扫描电镜（S-4800，Hitachi 公司），透射电子显微镜（TEM-2100，Jeol公司），振动样品磁强计（7407，Lake Shore 公司）。实验用水为超纯水。

1.2 Fe3O4@C 微球的制备[17]

称取1.2 g二茂铁溶于40 mL 丙酮中，超声分散使其完全溶解，然后将2 mL过氧化氢加到上述混合液中，磁力搅拌30 min。接着将混合液转移至100 mL的不锈钢高压反应釜中，加热到200 ℃后保温反应48 h。反应结束后自然冷却到室温，将沉淀物用丙酮多次洗涤，舍弃上层清液，最后将黑色的产物在真空炉干燥，备用。

1.3 水溶性CdTe量子点的合成[18]

以二氧化碲作为碲源，3-巯基丙酸作还原剂制备水溶性CdTe。分别称取2 mmol CdCl2·2.5H2O溶解于100 mL蒸馏水中，在电动搅拌下加入5.4 mmol MPA；然后再用0.1 mol/L NaOH将溶液pH调节至9.0，最后加入0.5 mmol TeO2。混合液前驱体置于超声微波反应系统中加热回流3.5 h，得到红色荧光的CdTe量子点。

1.4 Fe3O4@C-CdTe 复合纳米粒子的合成

称取0.1g Fe3O4@C纳米粒子，超声分散于含有100 mL二次蒸馏水的三口烧瓶中，在电动搅拌下加入10 mL PDDA溶液（5 mg/mL），继续搅拌30 min后，再向三口烧瓶中加入10 mL CdTe量子点，反应8 h后磁性分离，用蒸馏水把未吸附的CdTe量子点清洗掉，得到层层自组装的 Fe3O4@C-CdTe复合纳米粒子。磁铁分离清洗。最后置于50 ℃真空干燥箱中干燥，备用。

1.5 Fe3O4@C-CdTe @SiO2-NH2微球的合成

取0.1 g Fe3O4@C-CdTe超声分散在20 mL二次蒸馏水和80 mL乙醇混合溶剂中。然后将混合液转移到250 mL三口烧瓶中，加1 mL 25%氨溶液和0.1 mL TEOS，室温搅拌6 h后，用磁铁分离，再用水和乙醇交替洗涤多次。将上述样品分散在 100 mL乙醇中，并加入2.0 mL APTES，在氮气保护条件下回流12 h后，得到Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2。用乙醇反复洗涤，磁铁分离。置于50 ℃真空干燥箱中干燥，保存。

1.6 Fe3O4@C-CdTe@SiO2-FA微球的合成

称取50 mg Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2超声分散到含有0.1 g FA、50 mg NHS和60 mg EDC的100 mL DMSO溶液中，然后转入到150 mL的三口烧瓶中搅拌24 h。最后将所得产物磁性分离后用无水乙醇洗涤多次，最后置于50 ℃真空干燥箱中干燥，保存。

2 实验结果与讨论

2.1 红外光谱(FTIR)分析

图2 分别为(a) Fe3O4, (b) Fe3O4@C, (c)Fe3O4-CdTe, (d) Fe3O4-CdTe@SiO2-NH2, (e), Fe3O4-CdTe@SiO2-FA, and (f) FA的红外谱图Fig. 2 The FI-IR spectra of (a) Fe3O4, (b) Fe3O4@C, (c)Fe3O4-CdTe, (d) Fe3O4-CdTe@SiO2-NH2, (e),Fe3O4-CdTe@SiO2-FA, and (f) FA

图2为纯的Fe3O4、Fe3O4@C、Fe3O4@C-CdTe、Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2、Fe3O4@C -CdTe@SiO2-FA和 FA的红外光谱图。从图2a-e的谱线可以看出，位于585 cm-1处均有比较强点的Fe-O键振动吸收峰，说明样品中均有磁性纳米Fe3O4的存在。谱线b为包覆了一层无定型碳后Fe3O4@C的红外光谱，我们可以看出，与纯的Fe3O4相比，位于2 935和 2 835 cm-1出有比较强的C-H吸收峰出现。谱线c为化学耦合量子点后形成 Fe3O4@C-CdTe吸收光谱，从图中可以看出，1 559 和 1 402 cm-1处出现了是羧基的伸缩振动吸收峰。这是因为所制备的CdTe量子点外表面包覆了一层巯基丙酸，而带有大量的羧基。谱线d是Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2的红外光谱，从图中可以看出在790, 960和1 082 cm-1出均有Si–O的特征吸收峰，同时在1 471 cm-1处也出现了-NH2的振动吸收峰。当 FA耦合到Fe3O4@C-CdTe@SiO2表面后，我们从与图2e看出，在1 604 cm-1处出现较弱的苯的共轭双吸收峰。由此可见，合成的双功能微球与理论上的结构基本一致。

2.2 SEM形貌分析

通过SEM和TEM电镜分析可以清晰的观察样品制备过程中壳层的厚度、形貌、尺寸的变化。由图3a的SEM照片可见，通过一步溶剂热法合成的Fe3O4@C颗粒为均匀球形，粒径分布较均匀，分散性较好，表面比较光滑，但是有少许粗糙的杂质出现，可能是因为少量的二茂铁还没反应完全造成，样品的平均粒径在150～200 nm左右。由图3b SEM可以看出，当附着 CdTe量子点后，颗粒表面光泽度增加，且有聚电解质PDDA和量子点结合而成的薄膜出现，复合物颗粒的尺寸与包覆前比较变化不明显，因为制备出来的水溶性 CdTe量子点的粒径只有3 nm左右[18]。当在Fe3O4@C-CdTe复合物的最外层包覆上SiO2壳层后，复合物的粒径明显增加，平均粒径在180～250 nm左右，但是因为是一步法在SiO2表面进行胺基改性，所以制备出来的样品团聚比较明显，如图3c-d所示。从插图3d 的TEM照片中看出，我们可以看出SiO2壳层的厚度大约在20 nm左右。

图3 为(a) Fe3O4@C，(b)Fe3O4@C@CdTe和(c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的SEM谱图和(d) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的TEM谱图Fig.3 SEM images of (a) Fe3O4@C，(b)Fe3O4@C@CdTe，(c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2and TEM images of (d) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2

2.3 XRD 和 EDS 分析

通过XRD表征，研究了磁性Fe3O4@C核、包覆CdTe量子点和SiO2壳层后复合粒子的结构及相组成，如图4A所示。

由图4A(d)可见，所有衍射峰的位置和相对强度与尖晶石型Fe3O4（PDF No.19-0629）标准谱非常吻合[19]，并没有出现任何杂峰，表明包覆了碳层后并没有改变样品的晶型结构。由图4A (b，c)可以看出，当Fe3O4@C外层依次包覆CdTe量子点和SiO2壳层后，复合粒子中，相对应于尖晶石型 Fe3O4的衍射峰明显减弱，并可以清晰地看出复合物中出现了与CdTe量子点标准卡片（JCPDS No. 19-0629）相对应的特征衍射峰。另外，通过EDS电子能谱，我们对样品元素组成做了粗略的分析，由图4B可以看出，样品Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2分别存在Fe、O、C、N、Cd、Te 和Si 元素。

图4(A)为CdTe, Fe3O4@C and Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的XRD谱图；(B)为Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2的EDS谱图Fig.4 (A) XRD patterns of CdTe, Fe3O4@C and Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2microspheres; (B) EDS dataof the as-prepared Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2microspheres

2.4 磁学性质分析

图5 (a) Fe3O4@C, (b) Fe3O4@C@CdTe, (c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2, (d) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-FA的VSM谱图Fig.5 VSM patterns of (a) Fe3O4@C, (b) Fe3O4@C@CdTe, (c) Fe3O4@C@CdTe@SiO2-NH2, and (d)Fe3O4@C@CdTe@SiO2-FA microspheres

图5分别给出了Fe3O4@C、Fe3O4@C-CdTe、Fe3O4@C-CdTe@SiO2-NH2和Fe3O4@C-CdTe@ SiO2-FA的磁滞回线图。由图可以看出4种样品的饱和磁化强度分别为 76.4、60.2、30.0 和 21.9 emu·g-1。与单纯的Fe3O4@C相比，包覆后磁化强度明显降低。插图（上）为制备的 Fe3O4@C@CdTe@ SiO2-FA样品在可见光下拍出来的照片，图（下）为该样品在365 nm 紫外灯照射下拍出来的照片。表征结构表明，此荧光复合纳米仍然具有比较强的荧光。

3 结 论

先采用一步溶剂热法简单合成了碳包覆的磁性纳米Fe3O4, 并分别通过静电自组装、Stober和共价结合法制备了含有荧光、SiO2壳层和叶酸靶向识别的磁性复合纳米粒子。所得复合纳米粒子同时具有良好的发光性和较强磁性，其在生物医学领域将具有潜在的应用。

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Preparation and Performance of Folate-conjugated Magnetic /Fluorescent Bifunctional Microspheres

LI Yong-min，SHENG Mao

（Laboratory and Equipment Management Office, Taizhou University, Zhejiang Linhai 317000, China）

The functional imaging properties of magnetic microspheres composed of magnetic core and CdTe quantum dots in the silica shell functionalized with folic acid (FA) were investigated. The preparation procedure included the preparation of carbon-coated Fe3O4nanoparticles (Fe3O4@C NPs) prepared by a one-pot solvothermal method, the reaction by LBL in order to obtain the Fe3O4@C-CdTe NPs, and the growth of SiO2shell vent the photoluminescence (PL) quenching via a Stöber method. Moreover, in order to have a specific targeting capacity, the magnetic and fluorescent bifunctional microspheres were synthesized by bonding of SiO2shell with folic acid (FA) molecules via amide reaction. The morphology, size, chemical component and magnetic property of as-prepared composite nanoparticles were characterized by fluorescent spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD), scanning transmission electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), and vibrating sample magnetometer (VSM)，respectively. The results show that the magnetization saturation value of Fe3O4@C-CdTe@SiO2-FA NPs is about 21.9 emu/g, the size of nanoparticles is about 200 nm, and the magnetic and fluorescent bifunctional microspheres have strong luminescent which will be employed for immuno-labeling and fluorescent imaging of HeLa cells.

Folic acid; CdTe quantum dots; Fe3O4NPs; Solvothermal; Fluorescent

R 943

A

1671-0460（2015）03-0454-04

浙江省教育厅科研项目，项目号：Y201017414。

2014-12-18

李永敏（1982-），男，浙江仙居人，实验师，硕士，2012年毕业于浙江工业大学化学工程专业，研究方向：复合材料合成及分析。E-mail：1447792893@qq.com。