DNA条形码技术在肉类鉴别中的应用研究进展

张 伟，黄 涛，孙彩霞，汪 丹，万安思，陈其新，孙桂荣，李 明

（河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）

专论与综述

DNA条形码技术在肉类鉴别中的应用研究进展

张 伟，黄 涛，孙彩霞，汪 丹，万安思，陈其新，孙桂荣，李 明

（河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）

肉类掺假一直备受关注，关乎公共卫生、宗教因素、食品安全、消费者身心健康及不良的肉类市场竞争。应该通过快速、准确的肉类物种鉴别来保护消费者免受这些非法行为侵害。近年来，由于DNA条码技术较高的特异性和敏感性，以及简便性和热稳定性而被提议作为鉴别肉和肉制品物种来源的有利工具。文章简述了DNA条码技术在肉类鉴别中的应用研究进展，并对这种方法的优点进行了讨论。

DNA条形码；肉掺假；物种鉴别

肉是全世界大众消费的食品，因富含氨基酸、维生素、微量元素，且味道鲜美、营养价值高等受人喜爱。近年来的假牛肉事件引起人们的高度关注。肉类食品掺假对人们的日常生活造成很大的负面影响，不但严重危害消费者的利益和身心健康，也极易造成由于宗教信仰引发的矛盾和纠纷［1］；同时严重违反了肉类市场的公平竞争，对肉食品生产、加工、销售市场带来很大的冲击和经济损失，危害了国家食品安全。因此，在当今食品安全问题备受关注的形势下，进行肉及肉制品物种鉴别十分必要。为了检测肉及肉制品的物种来源，保护消费者免受这些恶意行为的侵害，维护国家食品安全，需要一个简单、准确的肉类物种鉴定方法。

历年的研究过程中，许多方法被用于肉类物种检测［2-3］，例如解剖学、组织学、感官、化学、生化、光谱、色谱、免疫学等，这些方法均有一定的局限性［4］。近些年来，基于DNA分子技术的发展，以DNA尤其是线粒体DNA为基础的物种鉴定方法优越性凸显。由于线粒体DNA在高温下的稳定性、普遍存在于大多数细胞和组织中、不受个体形态特征限制、不受个体发育阶段影响、便于提取获得（与常用基因组DNA提取方法无差异，无需特殊处理）等诸多优点而被广泛应用于生物学研究［5］。DNA条形码（DNA barcoding）已成为近年来国际上生物物种鉴定研究的热点，基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位基因I（cytochrome c oxidase I，COI）的DNA条形码技术在动物研究中已广泛应用，通过使用短的标准DNA片段，对物种进行快速、准确的识别和有效鉴定［6］。

1 肉类鉴别技术

1.1 肉类鉴别的重要性

肉类掺假是指蓄意替换肉类原料、篡改肉食品成分标签［7］。肉类食品的真实性和可追溯性是现代社会最重要的问题，它关乎经济、公共安全、宗教信仰、生态安全和食品安全。根据世界卫生组织的报告，肉及肉类产品的年产量稳步增长，预计2030年将增长到37.6亿t。我国是一个肉制品消费大国，伴随着肉产品市场的不断扩大，由于肉制品的品种和价格差异，不法商贩以低价肉类代替高价肉类出售，牟取暴利，导致肉类掺假事件频频发生。肉的掺假正成为国家和消费者密切关注的问题，不仅涉及国家食品安全，经济欺诈，也直接影响消费者的身心健康。此外，在清真食品中掺杂猪肉等将引起穆斯林和犹太人的强烈不满，导致民族和宗教信仰的问题［8］。2013年“马肉风波”席卷欧洲，此事发生在有着最严格食品安全监管制度的欧盟，引发了全社会对食品和肉品安全问题的广泛关注［9］。

肉类掺假对公众健康构成威胁。欧洲委员会在部分牛肉制品中检测出苯基丁氮酮药物残留，此药物经常用于马类，有助于止痛和退热，但对人类有害。一些疾病也与肉类食物源性成分密切相关，例如疯牛病、禽流感。肉类成分的替换可能引起过敏反应，例如虾仁等，标签中如果未标注，食用后将引起过敏体质者过敏，甚至过敏性休克。由于巨额利润的驱使，一些肉制品中发现濒危物种和野生动物成分，这些产品被交易导致相应物种数量的急剧减少，对生态系统安全构成严重威胁。

1.2 肉类鉴别技术的发展

肉类鉴别的方法从传统方法发展到现代的分子生物学方法，在不断的改善和优化［6］。传统方法主要基于解剖学，组织学，显微观察和感官（包括视觉、嗅觉、触觉、味觉等）。感官判别不能客观真实地鉴别肉类，可作为辅助手段应用。免疫学方法主要包括试管沉淀法、琼脂扩散法、对流免疫电泳法、放射免疫法、免疫组化法和酶联免疫吸附分析（ELISA），其中ELISA较为常用，但只适用于生鲜样品的检测。高效液相色谱等技术和无损检测技术包括超声波技术和近红外光谱（NIR）技术，即根据肌肉和脂肪厚度等一些参数的变化检测肉类的物理性质，可用于检测肉类组成成分，鉴别肉品种类、产地和真伪。此方法简便快速且信息量大、无破坏性，但需频繁维护和改进模型等导致成本较高［10］。

随着分子生物学技术的发展，基于DNA分子的鉴别技术受到广泛关注和研究［5］。聚合酶链式反应（PCR）技术是经典的分子生物学技术，通过设计特异性引物，扩增出特定目的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的DNA片段，以用于鉴别和检测。PCR技术用于肉类鉴别，关键在于能够找到各类物种特异性的基因片段，并设计引物扩增目的片段。常用的PCR技术有常规PCR、多重PCR（multiplex PCR）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、限制性片段长度多态性PCR（PCR-RFLP）、随机扩增多态性PCR（RAPD-PCR）等。DNA分子技术作为一种肉制品物种鉴别的有效方法得到广泛应用，可以克服许多传统方法的缺点［3］。主要优势之一是其操作简单及高鉴别力、高灵敏度和特异性。这是因为从DNA分子序列水平进行鉴别，可获得精确的结果，使得分析有效和可靠。另一个重要优点是灵敏度高［11］。然而鉴于核DNA的物种检测方法缺乏标准的鉴别序列，加拿大动物学家Hebert于2003年提出DNA条码技术［12］，类似于现代商品零售业的条形码系统（universalproductcode UPC），就像超市用条形码识别产品一样，以达到快速鉴别物种的目的。

2 动物DNA条形码技术

2.1 动物DNA条形码技术的发展

DNA条形码是指用线粒体基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定技术。该技术由加拿大圭尔夫大学的Hebert等人提出，他们通过对动物界中11门13 320个物种分析后，正式提出将一段长约710 bp的COI基因作为动物鉴定的通用条形码序列，用于物种鉴别和分类。2003年3月，20多位生物分类学家、分子生物学家和生物信息学家汇聚美国冷泉港，召开了题为“Taxonomy and DNA”即“分类学与DNA”的会议，提出对全球所有生物物种的某个特定基因进行大规模测序，以期实现物种鉴定的目标，进而推进生物进化历史的研究。同年9月，在冷泉港再次召开题为“Taxonomv，DNA and the Barcode ofLife”的会议，对DNA条形码鉴定所有真核生物的科学性、社会利益进行更深入的探讨，并且提出了组织策略及国际生物条形码计划（International Barcode ofLife Project）的发展蓝图。2004年，美国国立生物技术信息中心（NCBI）与生命条形码联盟（CBOL）签署合作，物种条形码的标准DNA序列及其相关数据将存档于GenBank。2005年2月，伦敦举办了第一届全球DNA条形码会议，对DNA条形码的分类理念、实验技术的细节分析以及资料库建立等议题进行了讨论，最终目的是联合各个类群的DNA条形码数据库组建一个全球生物的DNA条形码数据库。将此数据库设置在GenBank中，让公众可以自由登录查询。他们的工作推动了条形码技术在生物物种鉴定中的应用［13-14］。

动物主要以线粒体COI基因作为条形码标准片段［13］，DNA条形码技术是通过合适引物对COI基因的DNA序列进行PCR扩增、比对和分析，从而进行物种鉴定的技术。DNA条码技术依赖于一个国际平台——BOLD（生命条形码数据库）。BOLD是一个存储库，支持收集DNA条形码，目的是创建一个涵盖所有生物物种DNA条形码的数据库。为物种分类、鉴别和食品的可追溯性提供一个可靠的序列参考。DNA条形码技术在动物、植物、微生物的分类与鉴定中获得迅速发展［15］。动物DNA条形码技术目前主要运用于鸟类［16-18］、鱼类［19］、昆虫［20］的分类鉴定，其他物种分类鉴别工作也在同步开展，相应的条形码数据库也在不断完善。DNA条形码具有分子化、标准化和计算机化等数字化优势，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有广泛的应用前景［21］。

2.2 DNA条形码技术在肉类鉴别中的应用

DNA条形码技术在动物肉类鉴定中也得到广泛研究，应用于肉类掺假等食品检测，维护消费者的合法权益。DNA条形码技术被美国食品药品监督管理局提议为鱼肉制品鉴别的方法并计划写进鱼类监管百科全书，以助于鱼肉掺假检测和追溯［22］。DNA条形码技术在鱼肉产品鉴定中的应用为鱼类产品的分类鉴定开辟了新道路。在海产品鉴别中，邱德义等［23］以DNA条形码技术鉴别进出口贸易抽检的鱼肉等水产制品的物种来源，用以判别其与申报的产品标签是否相符。分别提取鱼肉等样品的基因组DNA，以目前国际上比较公认的动物线粒体细胞色素氧化酶COI基因通用引物进行PCR扩增。PCR产物经测序分析后，将得到的扩增片段序列与GenBank数据库进行序列比对，同时提交BarcodingLife DNA条形码数据库（BOLD）进行鉴定分析。结果显示：抽检的16份鱼肉、鱼丸等水产制品中除1份样品未能成功获得鱼肉COI PCR扩增外，其余15份样品均顺利得到种类来源鉴定，鉴定结果有31.25%的样品与产品标签标示不符。李新光等［24］为鉴别冷冻鱼、冻鱼片和烤鱼片中鱼肉成分的来源，用以判别其与食品标签是否相符，以COI基因为靶点，利用基因克隆和生物信息学方法建立鱼肉制品DNA条形码鉴别技术，对20种冷冻鱼、10种冻鳕鱼片和15种烤鱼片样品进行鉴定。结果表明：20种冷冻鱼鉴定的结果与形态学鉴定的结果一致；10种冻鳕鱼片样品主要以“狭鳕”为主（6/10），存在将“白鳕鱼”标识为“银鳕鱼”的现象；烤鱼片样品与其标签上所标识的原料多数不符，一些烤鱼片样品中检测出月尾兔头鲀成分。王敏等［25］以线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因为目标基因，应用DNA条形码技术鉴别深圳批发市场和超市零售鱼肉制品的种类来源，判别其产品标签是否正确。其中，调查的77份鱼肉制品均能扩增出特异性条带，28份样品与产品标签标示不符，“错贴”率高达36.36%，其中所有标示“龙俐鱼”的商品都是低价的“巴丁鱼”。Haye等［26］利用DNA条形码技术对智利市场上7种螃蟹制品进行鉴别，发现一种螃蟹制品与其商品标签不符，表明标准的DNA条形码与系统发育分析一样可用于规范蟹肉加工产品。Zhu等［27］运用DNA条形码技术鉴定了鳢的19个种，比较它们之间的种内差异和种间差异，证明了部分COI基因能够作为鳢种的DNA条形码。Rehman等［28］应用DNA条形码技术从巴基斯坦进出口贸易鱼肉产品中检测出濒临绝种野生动植物国际贸易公约中禁止销售的印度箱鳖，属于非法走私。Liu等［29］用一段391 bp的COI区段对台湾市场消费鲨鱼种类的多样性进行了检测和分析，即使在鲨鱼被加工成鱼片，物种特异性性状无法获知的情况下，依然可以通过DNA条形码技术成功鉴别。检测出被列入濒危物种第2期附录清单中的物种，为台湾鲨鱼多样性的保护提供参考。DNA条形码技术还应用于北美［30］、菲律宾［31］、印度［32］、南非［33］、巴西［34］、意大利［35］等国家的海产品市场，成功地检测与鉴定了市场上所售海产品的种类，发现与商品标示不符合等掺假问题。上述研究表明，DNA条形码技术对鱼肉及海产品的检测与鉴定具有可行性。

Luo等［36］对真哺乳动物亚纲1 179条线粒体基因组序列中各蛋白质编码基因评估其作为DNA条形码的效力，结果表明COI基因5’端是真哺乳动物亚纲的物种识别研究中首选的DNA条形码。马英等［37］为弥补传统形态分类方法的不足，用DNA条形码技术检测了青海省海东地区3目6科14属18种110只小型兽类的COI基因部分序列。分析发现，有6个个体（4只黄胸鼠、2只小家鼠）在现场鉴定中被误定为其他种类。表明条形码技术能纠正形态学鉴定中的错误，也说明动物线粒体COI基因是一个有效的DNA条形码标准基因。莫帮辉等［38］指出DNA条形码可在检疫检验领域中实现非专家检定，对进出口口岸生物监测具有重要的应用价值。孙敏等［39］选择狐狸线粒体COI基因序列，设计特异性引物和探针，经条件优化和验证，建立了狐狸成分的实时荧光PCR检测方法，灵敏度高，检测限可达12 fs DNA，而且与常见的猪、牛、羊、犬以及大豆、玉米等其他物种无交叉反应。可作为食品和饲料中狐狸源性成分鉴别检测的有效方法，也可作为狐狸皮毛真伪鉴别的方法。Müller等［40］对巴西南部的啮齿动物进行了鉴别，并了解了他们的地理分布情况，因为啮齿动物是很多病原的贮主，可以为当地的公共卫生安全提供参考。Quinto等［41-42］对美国市场内的野生动物肉类进行了检测，18.5%的肉样与标签不符，9.3%的样品中检测出了濒危动物野牛和狮子等肉成分，发现美国野味肉市场存在掺假现象。Cai等［43］利用COI基因对18种牛进行了研究，结果验证了COI基因作为鉴别牛科动物DNA条形码的有效性。欧阳解秀等［44］研究了DNA条形码技术在地方猪种质资源保护中的应用及其可行性。徐向明［45］测定3个地方鸭品种的线粒体COI基因，发现其种间的多态性高于种内多态性，可以进行品种鉴定。DNA条形码技术已被证明对不同鸡品种鉴定具有有效性和可行性，能够对不同地方鸡种进行分类。高玉时等［46］以我国6个地方鸡品种为研究对象，测定了COI基因的两段序列，发现线粒体COI基因中的Bar1序列（Bar1：712～1 359位）更适合作为条形码鉴定地方鸡品种。王爽等［47］对常见的牛、羊、猪、鸭4种肉类及相关肉制品进行掺假鉴定，判别与产品标签是否相符，以COI基因为靶基因，建立了4种动物源性食品DNA条形码鉴别技术。筛选出最优序列，在4个物种中扩增效率100%。对抽检的20个批次的肉加工品样品进行检测，鉴定结果约有90%的样品与产品标签标示的成分相符。其中1个批次的牛丸制品因肉类成分含量低未扩增成功，1个批次的牛丸制品检出鸭源成分，判定掺假。Kane等［48］对牛、羊、猪、鸡、火鸡、马肉样品进行了RT-PCR检测，48份样品中有10份与商品标签不符，且在两个样品中检测出美国市场不允许销售的马肉成分。分析发现，网上所购买样品的掺假率高于当地肉商品市场购买样品，超市样品的掺假率最低。Haider等［49］用线粒体COI基因PCR-RFLP方法成功鉴别了牛、羊、猪、鸡、火鸡、水牛、骆驼和驴8个物种。证实DNA条形码技术用于畜禽生肉鉴别的有效性。Dai等［50］用线粒体COI基因多重PCR方法成功检测了牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉，检测灵敏度可以达到0.001 ng，用此方法检测羊肉中人工掺杂的猪肉，检测限可以低至0.1 mg，并可应用于皮革和羽绒等的物种鉴别。田金辉［51］采用PCR-RFLP方法对猪、羊、牛3个物种的COI基因进行酶切，经HinfI酶切后均可获得3个物种特征片段长度段，能够对食品中的猪、牛、羊3种动物源性成分进行定性鉴定。马岩涛等［1］利用DNA条形码技术对羊肉、牛肉、猪肉、狗肉、驴肉5种肉类进行成功鉴定，并申报了专利。

COI基因作为公认的DNA条形码被认为能够很好地对动物进行分类鉴定。以上所有的研究证实作为一种简单、快速、可靠、有效的分子鉴定技术，DNA条形码可以直接应用于肉类食品物种来源的鉴定。

2.3 DNA条形码技术在肉类鉴别中的优点

肉制品加工是一条很复杂的工业链，处理肉类产品的过程中由于温度、pH值变化、组织细胞完整性被破坏和DNA酶的释放等，很容易引起DNA降解，完整性的破坏减少了DNA片段的长度和PCR扩增的有效性。然而线粒体DNA是一种闭合的、双链环状的核外遗传系统。其环状特性保证了其相对完整性和热稳定性，在深加工的肉类食品中有相对足够量的DNA被用于PCR扩增，确保足够高的PCR产物含量。线粒体基因没有内含子，没有等位基因重组事件，是母系遗传的单倍体［2］。很多研究表明，COI是更好的识别物种的标准片段［52］。COI序列还具有标准、有足够变异、易扩增、片段自身在物种种内具有特异性和种间多样性等特点。COI序列足够的短，便于有部分降解的DNA扩增，是一段标准的DNA区段可用于鉴别不同的分类群，具有足够的变异性以区分不同的物种，属于单倍体和母体遗传，同时具有相对的保守性，便于用通用引物［53］进行扩增，包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统中的位置。并且COI基因的通用引物能够扩增绝大多数的动物物种。因此，其它基因更有优势。使用DNA条形码进行物种鉴定准确率高，检测灵敏度可以达到0.001 ng［54］。DNA条形码对研究人员的专业技能并无较高要求，生物学家和普通生物爱好者都可在短时间内掌握该技术，有利于该技术的推广和使用，在肉制品掺假检测中的应用，有利于维护食品安全，更好地保护消费者权益，更好地服务于大众与社会，实现肉类的非专家鉴别。

3 结语

DNA条形码技术从刚开始被提出用于生物分类和物种鉴别，发展到应用于肉类制品检测、鉴别和追溯体系。DNA条形码的广泛应用证实了这种方法的可靠性、简便性和广泛实用性。DNA条形码使科研和检疫检验工作更加高效，使过去专家才能掌握的物种鉴别方法简单化，被更多的科研工作者了解、学习和掌握，加速了物种鉴别进程。随着我国生物DNA条形码数据库的建立和不断完善，该技术将在肉类食品鉴别中发挥更完善的作用，为我国肉类食品安全检测和可追溯体系的建立提供参考。

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Application of DNA Barcoding in Species Authentication of Meat

ZhangWei，HuangTao，Li Ming，et al
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

Meat adulteration has always been a concern for various reasons，such as public health，religious factors，food safety，wholesomeness，and unhealthy competition in meat market.Consumers should be protected from these illegal practices of meat adulterations by quick and precise species authentication of meat.In recent years，DNA barcoding have been proposed as a powerful tool for identifying the species origin in meat and meat products，due to its high specificity and sensitivity，as well as simplicity and heat stability.This paper reviewed the current applications of DNA barcoding in species authentication of meat and the advantages of this method were also discussed.

DNA barcoding；meat adulteration；species authentication

Q95

A

2095-3887（2016）02-0053-06

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.015

2016-02-28

河南省现代农业产业技术体系项目（豫农科教（2013）14号）

张伟（1990-），男，硕士研究生。研究方向：动物遗传与分子鉴别。

李明（1965-），男，教授。研究方向：动物遗传与分子育种。