产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展

孙 雨，王晓英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，赵柏林，石 慧，宋晓晖

（中国动物疫病预防控制中心，北京102600）

产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展

孙 雨，王晓英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，赵柏林，石 慧，宋晓晖

（中国动物疫病预防控制中心，北京102600）

产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌，是引起气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎等反刍动物疾病的主要病原。该菌能够分泌α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等多种外毒素，其中a、β、ε、ι毒素是主要的致病因子。产气荚膜梭菌引起的疾病通常发病急、死亡快，因此，疫苗免疫是预防该病的主要方法。近年来，随着对a、β、ε等毒素功能研究的深入，研究毒素相关的基因工程亚单位疫苗成为研究热点，并且有望弥补传统类毒素疫苗的安全性不高、稳定性差等缺点。文章从产气荚膜梭菌的病原学特点、主要外毒素的致病机制以及毒素相关疫苗的研究进展进行综述，以期为产气荚膜梭菌的综合防控和基因工程亚单位疫苗与核酸疫苗的研发提供一定的参考。

产气荚膜梭菌；外毒素；致病机制；疫苗

产气荚膜梭菌（C.perfringens）是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成动物机体组织大面积坏死，加之此菌在体内能形成荚膜，故名产气荚膜梭菌［1］。该菌是由英国科学家Welchii和Nuttad首先从一位死亡8 h后的病人体内分离得到，并以发现者Welchii的名字来命名［2］。产气荚膜梭菌主要的致病因是其分泌的外毒素，目前已经分离到的外毒素有13种，其中α、β、ε和ι是最主要的毒素因子，根据这几种外毒素的不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D和E等5个血清型。反刍动物的气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎、牛羊猝死症、羔羊痢疾均是由产气荚膜梭菌引起［3］。产气荚膜梭菌作为肠道正常菌群的一种，普遍存在于动物和人的肠道内，在正常情况下并不致病，但在动物感染大量病原菌，并且应激反应导致机体抵抗力降低时等，肠道内的产气荚膜梭菌会大量繁殖，同时会产生大量外毒素，外毒素进入血液循环引发的毒血症对机体器官组织造成损伤，并且引起动物死亡。由该菌导致的疫病具有发病急、病程短、死亡率高等特点，药物治疗很难达到效果，因此疫苗预防是控制该病的主要手段。80年代初，我国成功研制出产气荚膜梭菌病的单价苗和多联灭活疫苗，在预防由于产气荚膜梭菌引起的疫病方面发挥了重要作用。但在疫苗生产过程中，毒素的产生量对培养时间、温度、接种量以及培养基质量有着较高的要求，而且传统疫苗还存在安全性不高、稳定性差等缺点，因此，开发一种能够预防多种产气荚膜梭菌感染的基因工程多价亚单位疫苗或者核酸疫苗成为产气荚膜梭菌病防控技术中迫切需要解决的问题。

1 病原特征

1.1 病原的基本特征

产气荚膜梭菌的菌体较大，为革兰氏阳性粗短大杆菌，无鞭毛，有芽孢，有荚膜。该菌厌氧不严格，芽孢呈椭圆形，位于次级端。菌落直径2～5 mm，血琼脂平板上有溶血圈，糖发酵能力强，能产酸产气。在牛乳培养基中呈暴烈发酵现象是本菌的特征之一。产气荚膜梭菌能够产生α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等12种外毒素，产生的外毒素能够损伤细胞膜、血管内皮细胞并使糖类分解，发生细胞坏死、组织水肿、充气等病变［4］。菌株可产生肠毒素，能引起食物中毒，细菌DNA中的G+C分子含量为24%～27%。该菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，会散发臭味，动物机体常因深部创伤而感染。此外，产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎等［5］。

1.2 病原的发病机制

产气荚膜梭菌的致病条件与肉毒梭菌和破伤风梭菌相似。虽然产气荚膜梭菌产生的毒素的毒性不如肉毒梭菌和破伤风梭菌产生的毒素强，但是由于产生毒素的种类多，以及具有卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和DNA酶等多种对细胞有毒性作用的酶，使产气荚膜梭菌具有很强的侵袭力［6］。根据细菌产生α、β、ε和ι等外毒素的种类差别，可将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E五个型。A型菌主要产生α外毒素，能引起动物的坏死性肠炎、肠毒血症，B型菌产生的毒素主要为α、β、ε三种外毒素，可引起羔羊痢疾、山羊、绵羊及马属动物的肠毒血症，C型菌主要产生α、β两种外毒素，能引起人和家畜坏死性肠炎、反刍类动物的肠毒血症、羊猝狙等，D型菌主要产生α、ε两种外毒素，可以引起反刍动物的肠毒血症，E型菌主要引发动物的肠炎。

2 产气荚膜梭菌主要毒素基因的研究进展

2.1 α毒素基因（plc）

α毒素是产气荚膜梭菌所有毒素基因中最重要的一种外毒素，A、B、C、D、E等5个型的细菌均可产生该毒素。编码α毒素的基因plc位于染色体上，大小为1194bp，可以编码398个氨基酸，分子量为42.5 Ku，其中成熟肽和信号肽分别由370个氨基酸和28个氨基酸组成。目前国内外学者对α毒素基因的功能及其致病机理研究较多。Kalender等［7］研究发现，卵磷脂酶C是该毒素的主要致病因子，它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶，具有鞘磷脂酶和磷脂酶C两种因子的活性，因此，α毒素能同时水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂这两种组成细胞膜的固有成分。α毒素的致病机理就是依靠这两种酶活性，将细胞膜的膜磷脂进行水解，从而破坏细胞膜结构，导致细胞快速裂解死亡。α毒素具有“热-冷”溶解现象，当把α毒素加热至70℃左右时，可以使毒素的溶血活性丧失，100℃时，其部分活性又可恢复。α毒素的活性可以被EDTA和乙醚偶联的磷脂酰胆碱抑制。此外，α毒素对胰酶敏感，接触后容易丧失活性。α毒素基因相对保守，虽然不同菌株之间有1.3%的核苷酸以及1.2%的氨基酸序列不同，但这些核苷酸与编码氨基酸的不同并不影响α毒素本身的活性。此外，各梭菌产生的α毒素均有一定的同源性，具有相同的特异性。α毒素基因的启动子能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因而α毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达，也可在大肠杆菌中得到高效表达。近几年来，对α毒素基因组中同毒素相关的氨基酸的研究取得了一定的进展，研究发现，α毒素中第68位上的组氨酸残基对毒素活性至关重要，若其残基被其它氨基酸残基取代，即可丧失其全部的活性与毒性。

2.2 β毒素基因（cpb）

β毒素可分为β1和β2毒素两种类型，两者同源性并不高。编码β1毒素的cpb 1基因位于质粒上，与葡萄球菌的γ毒素有30%核苷酸同源，分子量为34.5 Ku。β1毒素是一种穿孔毒素，可以损伤多种宿主细胞的细胞膜（如肠上皮细胞、内皮细胞等）。此外，通过影响钙离子在神经细胞膜内的分布，β1毒素可以影响神经组织的功能，破坏正常的神经传导。该毒素对于胰酶的蛋白水解活性高度敏感，接触后容易失活。β2毒素是一种新近报道的毒素。目前发现从患有坏死性肠炎、小肠结肠炎的牛羊及腹泻犬的肠内容物分离到的产气荚膜梭菌均可以产生β2毒素。编码该毒素的基因cpb 2位于质粒，分子量为28.5 Ku［8］。研究发现该毒素具有细胞毒性。

2.3 ε毒素基因（etx）

ε毒素仅见于B型和D型产气荚膜梭菌中，是牛羊产气荚膜梭菌疾病的主要致病因子。编码ε毒素的基因etx位于质粒上，大小为987 bp，分子量为32.7 Ku。ε毒素基因所翻译的蛋白前体在分泌初期并不表现毒性，蛋白合成后通过蛋白酶去除毒素前体N端的13个氨基酸和C端22个氨基酸后成为有毒性的成熟肽。ε毒素能够作用于真核细胞膜上的胆固醇和鞘脂，具有明显的细胞毒素作用［9］。ε毒素对不同细胞的敏感性不同，研究发现，ε毒素MDCK和G402细胞特别敏感。ε毒素是一种通透酶，能够造成动物上皮细胞和内皮细胞的通透性增加，导致毒素渗入机体器官，同时该毒素还能通过影响细胞骨架的功能而发挥毒性作用。研究发现，C末端氨基酸残基是毒素蛋白活性的关键，不同酶切产生的N、C末端氨基酸残基，产生的毒素蛋白的毒性也不相同。其中蛋白经过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切后毒素的毒力最强。近几年来，国内外学者对ε毒素研究较多，研究发现，ε毒素能够与大鼠突触小体上的受体结合形成七聚体复合物，该复合物能够导致细胞膜通透性改变，使得大量的钾离子外溢，从而细胞内的钠离子和氯离子浓度快速升高，有害物质快速进入机体细胞，导致细胞毒性甚至发生细胞死亡或者凋亡［10］。此外，对ε毒素基因组中关键性毒素基因研究发现，将毒素蛋白序列中的唯一组氨酸定向突变为色氨酸残基后，可导致毒素对小鼠失去毒性［11］。

2.4 ι毒素基因（itx）

ι毒素主要由E型产气荚膜梭菌产生。ι毒素是一种二元毒素，编码基因Iap和Ibp全部位于质粒上，分子量为47.5 Ku。ι毒素由一个靶细胞结合部分（Ib）和一个酶激活部分（Ia）两个亚单位组成，其中Ia是毒性基因，Ib是结合基因。Ia毒素蛋白与肉毒梭菌的C2毒素作用类似，是一个ADP-核糖基化毒素，可以造成宿主细胞内肌动蛋白的核糖基化，从而造成细胞骨架的破坏和感染细胞的死亡［12］。目前对ι毒素蛋白的研究较少，毒素作用机制还不清楚。有研究认为，毒素与细胞表面的特异性受体结合后，Ib基因编码的蛋白在细胞膜表面形成一个孔道后，Ia基因编码的蛋白进入细胞，进而发挥毒性作用。

2.5 其他毒素基因研究进展

产气荚膜梭菌除了以上5种主要的毒素之外，还可分泌一些其它的毒素，如θ毒素、肠毒素、κ毒素、μ毒素和唾液酸酶等。产气荚膜梭菌形成芽孢时通常会形成并且释放肠毒素。肠毒素是一条单链的多肽，分子量为35Ku。编码肠毒素的基因cpe可同时位于质粒上，也可位于染色体上。肠毒素的氨基端发挥细胞毒性作用，羧基端与细胞膜上的受体结合有关［13］。θ毒素是一种胆固醇结合溶细胞素，也叫做产气荚膜梭菌溶血素，该毒素对氧较为敏感，各型产气荚膜梭菌均能产生θ毒素。编码θ毒素为pfo A基因，该基因位于染色体上。pfo A基因编码的蛋白质共有527个氨基酸，其中信号肽为27个氨基酸组成，成熟肽为500个氨基酸组成［14］。θ毒素能够结合在细胞膜上，并在膜表面形成一个小孔，造成细胞穿孔死亡。κ毒素是由产气荚膜梭菌col A基因编码的一种胶原酶前体，去除信号肽后成为胶原酶，除了信号肽序列外，在信号肽序列中还发现了一个胶原酶的底物序列，由此推测该蛋白前体的活化方式可能是自我催化激活。μ毒素是一种透明质酸酶，它的作用是有助于菌体细胞在组织中的扩散。唾液酸酶主要作用于真核细胞壁上糖复合物的唾液酸残基，可以造成细胞间基质的破坏［15］。

3 产气荚膜梭菌疫苗研究进展

3.1 传统疫苗研究进展

传统疫苗主要有单价疫苗、灭活疫苗和多联疫苗。单价疫苗是利用同一致病微生物的单一血清型菌、毒株的增殖培养物制备的疫苗。目前我国已经研制出肠毒血症和羔羊痢疾等单价疫苗。不同微生物或其代谢产物组成的疫苗称为联合疫苗或联苗。近些年来国外的疫苗生产厂商相继研究出了产气荚膜梭菌的四联、五联、七联和八联苗，这些联苗不仅把各种亚型的梭菌苗联合起来进行防疫，而且还把梭菌苗与沙门氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌等菌苗联合起来，甚至可以与病毒苗联合起来进行防疫。目前我国已经有了羊黑疫、快疫二联苗，羊猝狙、羊快疫二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。近几年我国还研制出了羔羊痢疾、羊快疫、肠毒血症、羊猝狙、羊黑疫五联苗，并取得一定预防疾病的效果。传统疫苗在治疗和预防反刍动物因产气荚膜梭菌感染而引起的疾病方面虽然取得了一定的成果，但是这些疫苗在临床使用过程中仍然暴露了一些不足，例如单价苗难以抑制各种亚型细菌的混合感染，多联苗免疫易引起动物的副反应等。

3.2 基因工程亚单位疫苗研究进展

基因工程亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物、蛋白质或多肽制成疫苗。这种类型疫苗的优点是安全性高，稳定性好，纯度和产量高，同时还可将多种致病毒素通过基因工程手段连接在一起构建新的毒素蛋白进行表达。基因工程亚单位疫苗可以通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构，在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球，或加入有免疫增强作用的化合物（佐剂）来增强免疫效果。用于基因亚单位疫苗生产的表达系统主要有大肠埃希氏菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞、转基因植物、转基因动物等。Pilehchian等［11］尝试将产气荚膜梭菌的ε和β基因进行了融合，并部分表达出与天然蛋白具有相似生物学活性的可溶蛋白，然后用脱毒的蛋白免疫的小鼠获得了90%的免疫保护力。Zeng等［13］还将重组的各种毒素用甲醛灭活，再加入佐剂制成疫苗，然后将它与羊痘疫苗结合起来对羊进行免疫，结果显示，被免疫的羊同时获得了羊痘和肠毒血症的保护性。Miyamoto等［5］将ε毒素基因克隆到相关质粒中，并转化到大肠杆菌感受态细胞中，重组的ε毒素经过灭活后，加入相应佐剂免疫反刍动物，二免后抗体滴度迅速上升，测定重组毒素具有针对产气荚膜梭菌的免疫保护性［16］。

3.3 核酸疫苗研究进展

核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗是利用现代生物技术与免疫学方法研制成的，分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。但目前对核酸苗的研究以DNA疫苗为主。DNA疫苗又称为裸疫苗，因其不需要任何化学载体而得此名。DNA疫苗导入宿主体内后，被组织细胞、抗原递呈细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗的优点是免疫保护力增强，疫苗接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHCI或II类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，对慢性感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防更加有效。目前国内外学者都非常重视牛羊产气荚膜梭菌核酸疫苗的研究［19］。核酸疫苗虽然在一定程度上提高了免疫效应，但疫苗本身的安全性，DNA免疫的作用机理以及如何提高进一步免疫水平仍然需要进一步研究。

4 研究展望

产气荚膜梭菌的外毒素是病原菌生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物，为次级代谢产物，它是一类基因编码翻译而成的蛋白质，能刺激宿主免疫系统产生良好的免疫应答反应，不但可刺激机体产生抗毒素，而且可中和外毒素。这些毒素蛋白可以作为非常好的免疫原，抵抗异源毒素的攻击，有效预防由多型产气荚膜梭菌所引起的牛羊疾病。现阶段对产气荚膜梭菌所引起的牛羊疾病的预防主要以单价苗和多联苗为主，但各有利弊，都不能很好地对该菌引起的疾病起到预防和治疗的效果。近几年基因工程亚单位疫苗也相继出现，但多数只针对单一毒素引起的疾病进行预防，虽具有一定的保护力，但对其他毒素引起的疾病或者多种毒素联合感染引起的疾病的保护效果不明显，因此研发有效多价基因工程亚单位疫苗或者核酸疫苗具有非常广阔的科研与应用前景。

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Progress in the Main Exotoxin Gene and the Related Vaccine ofClostridium Perfringens

Sun Yu，WangXiaoying，SongXiaohui，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

Clostridium perfringens is also called clostridium westergren，which mainly cause diseases in ruminants，such as gas gangrene，intestines toxemia，hemorrhagic enteritis of cattle and sheep.The bacteria are divided into five subtypes including A，B，C，D，E subtype，which can secrete more than 10 kinds ofexotoxin，such as α，β，ε，ι，γ，η，θ，κ，λ，μ，ν and soon.In these toxins，α，β，εandιplay a key pathogenic role.In the current situation，the disease are prevented mainly by the monovalent vaccine，combined vaccine and multivalent inactivated vaccine.However，the genetic engineering subunit vaccine and nucleic acid vaccine has wide development prospects.In order to provide some reference for the comprehensive prevention and deep research of Clostridium perfringens，the etiology characteristics of Clostridium perfringens，pathogenic mechanism of exotoxin and the research progress in related vaccine were reviewed，and the genetic engineering subunit vaccine and nucleic acid vaccine development prospects were alsodiscussed in this paper.

Clostridium perfringens；exotoxin；pathogenic mechanism；vaccine

S864.7

A

2095-3887（2016）02-0058-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.016

2015-11-17

农业部动物疫病监测与防治项目

孙雨，男，兽医师，博士，主要从事人畜共患病预防控制研究。

宋晓晖，女，高级兽医师，博士，主要从事草食动物疫病与人畜共患病的预防控制研究。