黄颡鱼“红头病”病原菌蜡状芽孢杆菌分离鉴定及药敏分析

胡宗云，宋文华，张涛，富丽静，李赫，姚福向，杨培民

（辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁省水生动物病害防治重点实验室，辽宁 辽阳 111000）

黄颡鱼“红头病”病原菌蜡状芽孢杆菌分离鉴定及药敏分析

胡宗云，宋文华，张涛，富丽静，李赫，姚福向，杨培民

（辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁省水生动物病害防治重点实验室，辽宁 辽阳 111000）

从患“红头病”黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco的肝、肾等组织中分离出致病菌，通过人工感染试验、生化鉴定及16SrRNA序列分析进行鉴定，采用K-B琼脂法进行药敏试验。结果表明：分离获得的优势菌株HHG有很强的致病性，鉴定为芽孢杆菌Bacillus cereus；该菌株对丁胺卡那、米诺环素、恩诺沙星3种抗生素高度敏感；对中庆大霉素、卡那霉素、新霉素、头孢哌酮等10种抗生素中度敏感，对头孢曲松、利福平和链霉素3种抗生素低度敏感，而对青霉素、苯唑西林、氨苄西林等14种抗生素具有耐药性。本研究结果可为有效防控黄颡鱼“红头病”提供参考。

黄颡鱼；红头病；蜡状芽孢杆菌；分离;鉴定；药敏分析

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco肉质细嫩，无肌间刺，多脂肪，蛋白质含量为15.37%，脂肪为16.1%，17种氨基酸总量达14.79%，具有极高的营养价值[1]。黄颡鱼肉性味甘、平，有祛风、利尿之功效，有一定的药用价值，深受消费者的青睐。近几年来随着养殖规模扩大和养殖密度提高，黄颡鱼出现了各种各样的疾病，如病毒病、细菌病和寄生虫病，造成严重的经济损失[2-4]。近年来，辽宁、湖北、浙江、四川等地养殖的黄颡鱼暴发了一种称为“红头病”的流行病，又称为“红脑门病”、“裂头病”，主要症状为：病鱼头朝上尾朝下在水面间歇性螺旋状转悠；腹部膨大，鳍条基部、口腔、下颌、鳃盖、眼眶充血，头顶正中部位皮下发红，严重时头骨裂开，在头顶部出现一条狭长的溃烂出血带，呈现典型的“红头病”症状；解剖腹腔，内有少量血水或透明腹水，肝脏有点状或块状出血，胆肿大呈紫黑色，胃、肠道发白，肠内无食。该病在每年的4～6月和9～10月流行，主要危害25～100g的黄颡鱼种或成鱼，传染性强，发病感染率可达10%～30%，死亡率高达70%，给养殖业造成了严重的经济损失。为研究黄颡鱼“红头病”的病因，科学防控黄颡鱼的“红头病”，本文开展该病的病原分离、纯化、鉴定及药敏试验工作。

1 材料与方法

1.1 材料

发病鱼取自辽宁省灯塔市忠信集团的黄颡鱼养殖基地，用于人工感染的健康鱼购自辽宁省灯塔市良波渔场。发病鱼与健康鱼大小相近，体长12～15cm，体质量35～45g。

1.2 方法

1.2.1 患病鱼的细菌分离

取典型患“红头病”黄颡鱼，用75%酒精消毒体表后，按照无菌操作的方法，用灭菌手术剪剪开其头部及腹部，观察脑及内脏的感染情况，未见寄生虫；分别取脑、肝脏、肾脏、鳃及腹水，匀浆后接种于普通营养琼脂平板上，28℃恒温培养48h后，挑取形态特征一致的优势菌（编号HHG），进行分离纯化、保种。

1.2.2 人工感染试验

在水温（24±2）℃下，将健康黄颡鱼在50cm× 38cm×30cm的水族箱中暂养7d，定期投喂配合饲料，及时清污，日换水量1/3。将分离纯化的菌株HHG在普通营养肉汤中培养24h后，用灭菌的10号针头腹腔注射于健康黄颡体内，菌液0.1mL，浓度为105CFU/mL，每日换水1/3；对照组采用相同方式注射相同体积的液体培养基，日常管理同试验组。连续观察、记录其发病症状，取发病鱼的肝脏、肾脏、鳃及腹水进行病原菌的再分离、鉴定。

1.2.3 细菌的鉴定

1.2.3.1 细菌的菌落形态及细菌大小、形状观察

取试验用菌株划线接种于普通营养琼脂平板，28℃培养24h，观察菌落特征。常规生理生化特征参照《常见细菌系统鉴定手册》[5]进行常规鉴定。

1.2.3.2 生理生化鉴定

采用API/ATB半自动化细菌分析仪鉴定，将HHG菌株接种于营养琼脂平板，28℃培养24h后挑取菌落混于生理盐水中，用API/ATB光电比浊仪测量配成0.5mol/L McFarland的菌悬液。吸取菌悬液接种ID32E测试卡（55μL/孔），置于35℃培养箱孵育24h。取出测试卡置阅读器上检测反应结果，并转换为能被计算机接受的反应编码，最后由计算机判定鉴定结果。

1.2.3.3 细菌16SrDNA的鉴定

将分离纯化的菌株直接送到上海生工测序公司，用细菌通用引物扩增、纯化，测定细菌的16S rDNA序列，将测得的菌株16S rDNA序列输入到GenBank数据库中进行BLAST比对，同时从Genbank下载芽孢杆菌属多个序列利用MEGA4.1软件包进行序列比对，并采用邻接法（Neighbor-joining method）分析同源性，构建系统发育树。

1.2.4 药物敏感性试验

待测菌株在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养24h，用无菌生理盐水洗下，制成108CFU/mL的菌悬液，取0.1mL涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，将药敏纸片（杭州微生物有限公司生产）贴于该培养基上，28℃恒温培养24h后，测量抑菌圈直径。根据抑菌圈的大小，进行敏感性判断。

2 结果与分析

2.1 病原菌的菌落特征

从病鱼的脑组织匀浆液涂布的培养基中未见有细菌长出，而在肝脏、肾脏、鳃及腹水等组织的普通营养琼脂平板中可见大量形态特征均一致的圆形或近圆形菌落，菌落直径5～7mm，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状，质地软，无色素，呈稍有光泽的白色。在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有溶血环。在显微镜的油镜下观察发现，细菌呈杆状，末端方，成短或长链，大小为（1.0～1.2）×（3.0～5.0）μm；产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生；革兰氏染色阳性，无荚膜，具运动性。

2.2 病原菌的人工感染

将菌株HHG感染健康黄颡鱼72h后，发病早期头顶凹陷处出现“线状”浅红色充血带（图1-2），随病情加重，后期凹陷处肿胀甚至溃烂，与自然感染症状基本一致（图1-1）；从发病的肝、肾等组织中再次分离到与实验菌株HHG形态特征、理化性质完全一致的菌株，表明分离菌株是黄颡鱼“红头病”的病原菌。

2.3 细菌的生理生化特征

菌株HHG生理生化特征经梅里埃ID 32E试剂条鉴定结果表明，菌株HHG隶属于芽孢杆菌属Bacillus sp.（表1）。

图1 黄颡鱼自然发病和攻毒试验后的症状Fig.1 Symptoms of red-head disease in pond-cultured yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco and in HHG-infected individual

表1 菌株HHG生理生化特征Tab.1 The physiological and biochemical characterization of HHG

2.4 细菌的16S rDNA序列分析

菌株HHG的16S rDNA大小为1 450bp，输入到GenBank数据库中进行比对，结果显示与蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的16S rDNA聚为一类，序列同源性达到99%。结合细菌形状大小及生理生化特征，菌株 HHG鉴定为蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus，其系统发育树如图2所示。

图2 菌株HHG 16S rDNA序列与其他细菌亲缘关系及进化树Fig.2 Phylogenetic tree of strain HHG and its closest relatives based on 16S rDNA sequence

2.5 菌株HHG对不同药物的敏感性

菌株HHG对30种常见抗生素中的丁胺卡那、米诺环素、恩诺沙星3种抗生素高度敏感；对庆大霉素、卡那霉素、新霉素、头孢哌酮等10种抗生素中度敏感；对头孢曲松、利福平和链霉素3种抗生素低度敏感；而对青霉素、苯唑西林、氨苄西林等14种抗生素具有耐药性（表2）。

3 讨论

黄颡鱼“红头病”在我国各养殖区均有发生，每年给黄颡鱼养殖业造成重大经济损失。黄颡鱼“红头病”常由爱德华氏菌感染引起，比如迟钝爱德华氏菌Edwarsiella tarda[6,7]、鲇爱德华氏菌Edwardsiella ictarda[8]和鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri[9]。与上述报道不同，本文通过对从具有“红头病”典型症状的黄颡鱼体内分离的致病菌HHG的形态观察、生理生化试验发现，该菌株属性与芽孢杆菌属相近；经16S rDNA序列克隆、测序比对分析表明：该菌株与蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus序列高度一致（99%）。这表明黄颡鱼“红头病”病原菌不局限于爱德华氏菌属，病原具有多样性的特点。蜡状芽孢杆菌的分离和鉴定对黄颡鱼“红头病”预防、快速检测及治疗具有重要意义。

表2 分离菌株对药物的敏感性Tab.2 Sensitivities of the isolated strain to antibiotics

蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus能产生芽孢，对外界有害因子的抵抗力非常强，在自然界中分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中亦常见。蜡状芽孢杆菌无毒菌株具有促进动物生长、提高免疫力以及预防疾病等优点，已作为益生菌被广泛用于饲料、农业、水产养殖等领域[10]；而有毒菌株具有致病性，可通过食物中毒引起人体腹泻和呕吐[11]，是一种食源性病原菌，该病菌也可引发出血病[12]、角膜炎[13]、急性眼内炎[14,15]。在水产上，蜡状芽孢杆菌可引发对虾“黑鳃病”[16]、刺参“腐皮综合征”[17]，也可造成军曹鱼[18]和罗非鱼[19]大量死亡，而在患“红头病”的黄颡鱼中分离出的致病性蜡状芽孢杆菌尚属首次。现有的研究表明，蜡状芽孢杆菌是一种条件致病菌，其致病性受宿主和环境的综合影响，随着养殖密度增大，鱼体栖息环境越来越恶劣，蜡状芽孢杆菌很可能从机会致病菌成为常见病原体[19]。因此，养殖过程中要控制养殖密度，改善水体理化指标，为黄颡鱼生长提供良好水体环境；同时，在黄颡鱼养殖中需慎用含有蜡状芽孢杆菌的活菌制剂。

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Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogen Bacillus cereus from Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）with Red-head Disease

HU Zong-yun,SONG Wen-hua,ZHANG Tao,FU Li-jing,LI He,YAO Fu-xiang,YANG Pei-min
（Liaoning Key Laboratory for Prevention and Treatment of Aquatic Animal Diseases,Freshwater Fisheries Research Academy of Liaoning Province,Liaoyang 111000,China）

Pathogens were isolated from liver and kidney of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco with red-head disease,and identified by artificial infection test,biochemical system and 16S rRNA sequence analysis to investigate the cause of red-head disease in yellow catfish.In addition,a drug sensitivity test was carried out using K-B paper diffusion method.It was found that the superior strain HHG exhibited strong pathogenicity to yellow catfish and was identified as Bacillus cereus via biochemical identification and 16S rRNA sequence analysis.The superior strain was shown to be highly sensitive to 3 kinds of drugs including Amikacin,Minocycline and Enrofloxacin,moderately sensitive to 10 kinds of drugs including Gentamycin,Kanamycin,Neomycin and Cefoperazone,and slightly sensitive to 3 kinds of drugs like Ceftriaxone Sodium,Rifampicin and Strepolin.The superior strain,however,was resistant to 14 kinds of drugs including Penicillin,Ampicillin,Carbenicillin,and Piperacillin.The findings provide references with effectively prevent and control the red-head disease in yellow catfish.

Pelteobagrus fulvidraco;red-head disease;Bacillus cereus;isolation;identification;drug sensitivity test

S941

A

1005-3832（2016）04-0033-05

2016-03-19

辽宁省海洋与渔业厅项目（201302）.

胡宗云（1980-），女，工程师，从事水产动物病害防治研究.E-mail:huzongyun2004@163.com