三种体色黄鳝群体遗传多样性分析

凌俊，江河，胡玉婷，段国庆

（安徽省农业科学院水产研究所，安徽 合肥 230031）

三种体色黄鳝群体遗传多样性分析

凌俊，江河，胡玉婷，段国庆

（安徽省农业科学院水产研究所，安徽 合肥 230031）

利用线粒体Cyt b基因部分序列测序技术研究3种体色黄鳝Monopterus albus群体（深黄斑鳝、青黄斑鳝、青斑鳝）的遗传多样性与遗传差异。结果显示：三个群体黄鳝共有变异位点53个，单倍型36个；平均单倍型多样性分别为0.9153、0.7517、0.9457；平均核苷酸多样性分别为0.00426、0.00211、0.00601。群体间遗传分化指数（Fst）较小（0.00282～0.04970），分子方差分析（AMOVA）中仅有2.10%的变异来自群体间，表明三种不同体色黄鳝群体间未有明显遗传分化。群体遗传距离的聚类分析结果显示：深黄斑鳝与青黄斑鳝群体间亲缘关系最近，深黄斑鳝与青斑鳝亲缘关系最远。

黄鳝；体色；细胞色素b；遗传多样性

黄鳝Monopterus albus是我国重要的名优经济水产动物之一。长江中下游是中国黄鳝重要产出地，资源丰富。黄鳝营穴居生活，个体迁移范围较小，由于地理隔离、遗传及环境因素的影响，形成了不同体色的地方黄鳝品系，外观、生长性能、营养成分等差异很大[1-10]。江淮流域常见三种体色黄鳝，即深黄斑鳝：背部体色深黄，全身布满不规则褐黑色大斑点，排列成线，腹部花纹较浅；青黄斑鳝：背部体色浅黄，全身分布着不规则的褐黑色细密的小斑点，腹部花纹较浅；青斑鳝：体表泥灰色，背部体表花纹不明显，腹部布满花纹且颜色较深。三种体色黄鳝的繁殖力、生长性能、营养成分均有差异[5-7,10]。但有关不同体色黄鳝种质遗传结构的研究还较少，这三种体色黄鳝的遗传多样性差异尚不明确。

同其他脊椎动物类似，鱼类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、结构简单、进化呈中性、演化速度快、母系遗传、无重组、方便检测，及不同区域进化速率不同等特点，被广泛应用于鱼类分类学、群体遗传学、生物地理学等研究中。作为线粒体DNA中研究最为充分的基因，线粒体细胞色素b基因（Cytochrome b,Cyt b）具有恒定和较适中的进化速率，DNA序列易扩增，适于鉴别鱼类种间或群体间的遗传信息[11-13]。

为了有效地保护黄鳝野生资源及选育优良的黄鳝新品系，本文通过研究安徽常见的三种体色黄鳝的遗传多样性和遗传差异，以期为保护和合理利用黄鳝种质资源、丰富其生物多样性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2013年5～10月在安徽怀宁县（属长江水系）分别采深黄斑鳝28尾、青黄斑鳝30尾、青斑鳝24尾，以A、B、C代表（图1）。取黄鳝肌肉组织于无水酒精中保存备用。

图1 三种体色黄鳝Fig.1 The ricefield eel M.albus with three body colors

1.2 方法

提取基因组DNA：用天根生化科技（北京海）有限公司生产的试剂盒提取黄鳝群体基因组DNA，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增与测序：所用引物为本实验室根据GenBank中黄鳝线粒体基因组全序列（NO.：NC003192）用Primer 5.0软件设计。上游引物Cf：GAAGCAACACCAACTGATCCC；下游引物Cr：CAATTTTCGACTTACAAGGCC用于扩增与测序。PCR反应体系：10×Buffer（100mmol/L Tris-HCl（pH8.3），500mmol/L KCl和 15mmol/L MgCl2）5μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，引物（10mmol/L）各2μL，模板DNA（50ng/μL）2μL，Taq DNA酶（5U/μL）0.3μL，加灭菌蒸馏水34.7μL使反应体系达50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性35s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化及测序。

数据处理：利用Clustal X[14]和Seaview软件[15]校对和拼接序列；利用DNAsp 5.0[16]统计多态位点数、单倍型数、单倍型多样性（Hd）与核苷酸多样性（Pi）；利用MEGA 4.0[17]计算序列碱基组成与变异率、群体内和群体间遗传距离，构建群体间系统进化树（NJ-tree）；利用Network软件（http://www.fluxusengineering.com/）制作单倍型进化网络图；利用Arlequin 3.5[18]计算遗传分化指数（F-statistics，Fst）和分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）。

2 结果与分析

2.1 序列多态分析

在黄鳝3个不同体色群体的82个样品中，经测序共获得82条长度为1 087bp的线粒体Cyt b基因同源序列，所有序列均无插入、缺失；检测到变异位点53个（变异率4.88%），其中简约信息位点35个，单突变位点18个。序列碱基变化中转换与颠换比率为17.38，符合鱼类线粒体核苷酸的替换中转换远多于颠换的规律。序列的平均碱基组成T、C、A、G依次为 29.8%、32.6%、24.4%和 13.2%；（A+T）含量54.2%明显高于（G+C）的含量45.8%，显示了较强的反G偏好，即G含量较低，尤其密码子第2位（13.5%）和第3位（3.3%）最为明显；而第1位的碱基组成相近（T：28.4%；C：25.3%；A：23.7%和G：22.5%），这与脊椎动物线粒体DNA碱基组成的特点相一致。

2.2 单倍型和遗传多样性

在3个不同体色黄鳝群体的82个样品中，共检测到36种单倍型（表1），单倍型间序列变异率为0.09%～1.38%。所有单倍型序列的GenBank序列登录号依次为KX155507～KX155542。3个群体仅有1个共有单倍型（Hap1），占全部样品的34.15%；两两群体间共有单倍型10个，占全部样品的31.71%；其余25个单倍型为各群体所特有，占全部样品的34.15%。单倍型简约进化网络图（图2）显示：三体色黄鳝群体的单倍型在各群体间几乎随机分布，没有明显差异。

表1 单倍型在不同体色黄鳝群体中的分布Tab.1 Haplotype distributions of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color

由表2可知，三种体色黄鳝群体的单倍型多样性均较高（0.7517～0.9457），而核苷酸多样性则较低（0.00211～0.00601）；C群体单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）均最高（Hd：0.9457，Pi：0.00601）；B群体单倍型多样性和核苷酸多样性均最低（Hd：0.7517，Pi：0.00211）。

2.3 群体遗传距离和分化

基于K-2P遗传距离模型计算黄鳝群体内、群体间平均遗传距离（表3），并以此遗传距离构建群体间系统进化树（NJ-tree）（图3）。A与C群体间遗传距离最大（0.005453），A与B群体间最小（0.003234）；部分群体间遗传距离小于群体内遗传距离，如C群体内遗传距离（0.006062）大于各群体间遗传距离，A群体内遗传距离大于A、B群体间遗传距离。群体内遗传距离反映该群体的遗传多样性，而群体间遗传距离反映其遗传组成的分化程度，这显示群体内存在较高遗传多样性，但这种遗传多样性在不同群体间还未积累到较大区别。聚类图显示（图3）：A和B群体先聚在一起，再与C群体聚为一支。

图2 三体色群体黄鳝单倍型进化网络图Fig.2 Statistical parsimony network of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color based on mtDNA Cyt b gene

表2 黄鳝各体色群体的遗传多样性参数Tab.2 The genetic diversity parameters of ricefield eel populations with 3 types of body color

不同体色黄鳝群体间遗传分化结果见表4和表5。两两群体间Fst值均小于0.05；分子方差分析（AMOVA）结果显示：仅有2.10%的遗传变异来自群体间，而群体内遗传变异占比高达97.9%，这表明不同体色黄鳝群体间未有明显遗传分化。

表3 三体色黄鳝群体内（对角线）和群体间（对角线下）的遗传距离Tab.3 Pairedgeneticdistances（belowdiagonal）and genetic distance within（diagonal）population of ricefield eel M.albuspopulationswith3typesofbodycolor

图3 基于线粒体Cyt b基因的三体色黄鳝群体间系统聚类树Fig.3 NJ-tree of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color based on Cyt b gene

表4 基于Cyt b基因的黄鳝3群体间Fst值Tab.4 F-Statistics from genetic distance of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color based on Cyt b

表5 黄鳝所有样本的Cyt b序列的分子方差分析Tab.5 AMOVA of Cyt b gene in samples of ricefield eel M.albus

3 讨论

3.1 不同体色黄鳝群体遗传多样性

遗传多样性或基因多样性是生物多样性的重要组成部分，是生物适应环境与进化的遗传基础，与物种或群体的环境适应能力呈正相关,是评价生物对环境适应和进化潜力的重要依据。线粒体Cyt b基因序列是检测鱼类群体间遗传多样性的重要分子标记，通常以核苷酸多样性（Pi）和单倍型多样性（Hd）为衡量指标。三种体色黄鳝群体中，C群体（青斑鳝）单倍型多样性和核苷酸多样性均最高（Hd：0.9457，Pi：0.00601），A群体（深黄斑鳝）次之（Hd：0.9153，Pi：0.00426），而B群体（青黄斑鳝）最低（Hd：0.7517，Pi：0.00211），表明三种体色黄鳝在线粒体Cyt b基因上的遗传多样性尚处于较高水平，存在较强的资源恢复潜能。但三种体色黄鳝之间遗传多样性的高低与已有的一些研究结果有差异。刘良国等[4]对洞庭湖区A、B、C三群体共15个黄鳝个体进行随机扩增多态性DNA分析，结果发现B群体的遗传多样性最高，C群体最低。周先文[19]对两种体色黄鳝的RAPD研究表明，黄色黄鳝群体遗传多样性大于灰色，这可能与实验采样频次有关。青黄斑鳝（B群体）在野外最常见，一次采样样品即足够，可能来源于亲缘关系较近的小群体；而深黄斑鳝、青斑鳝（C群体）野外不常见，需多次采样，来源较为分散，多样性更为丰富。自然界中深黄斑鳝数量较少，但其繁殖力[6]、生长速度[7]等均较高，具有较高的养殖价值，可为黄鳝优良品系的选育提供种质材料，因此要重视保护野生深黄斑鳝群体。

3.2 三种体色黄鳝群体遗传分化

群体遗传结构是指遗传多样性在种内不同群体间的分布，即遗传分化。通常认为，衡量群体间遗传分化程度的遗传分化指数Fst为0～0.05时无分化，0.05～0.15时中度分化，0.15～0.25时高度分化[20]。本研究中A、B、C任意两群体间Fst值均小于0.05，而分子方差分析显示，仅有2.10%的遗传变异来自不同体色黄鳝群体间。这充分说明，基于线粒体细胞色素b基因部分序列的三种体色黄鳝群体间没有明显遗传分化，这与三种体色黄鳝生活区域相同有关，基于K-2P遗传距离模型计算的群体内、群体间平均遗传距离也显示了群体间遗传多样性还未积累较大区别。但基于群体遗传距离的聚类分析结果显示：深黄斑鳝（A）与青黄斑鳝（B）群体间亲缘关系最近，深黄斑鳝（A）与青黄斑鳝（C）亲缘关系最远。这与刘良国等[4]基于RAPD的研究结果相一致，也与三种体色黄鳝群体繁殖力[6]、生长速度[7]和营养成分[10]等生物学指标的差异类似。这表明三种体色黄鳝遗传差异不显著，但不同群体间亲缘关系、生物学特性等具有一致的规律，这可能是所选分子标记不同所致。线粒体Cyt b仅涉及母性遗传，难以全面反应群体间的遗传差异，对于不同体色黄鳝的遗传多样性和亲缘关系需要更深层次的研究，特别是加强核DNA水平上的研究。

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Genetic Diversity Analysis of Three Populations of Ricefield Eel Monopterus albus with Different Body Colors

LING Jun,JIANG He,HU Yu-ting,DUAN Guo-qing
（Fishery Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China）

The genetic diversity in three populations of ricefield eel Monopterus albus with deep yellow spot（A）,green yellow spot（B）,and green colors（C）was investigated using mitochondrial Cyt b gene.53 mutations of nucleotide acids and 36 haplotypes were observed in 82 samples,with average haplotype diversity of 0.9153 in population A,0.7517 in population B,and 0.9457 in population C,and nucleotide diversity of 0.00426 in population A,0.00211 in population B,and 0.00601 in population C.The molecular variance（AMOVA）revealed that there was no significant genetic differentiation among the populations,with genetic differentiation index（Fst）of 0.00282～0.04970.The cluster analysis based on genetic distance among populations indicated that population A and population B had the closest phylogenetic relationship,and population A and population C showed the farthest phylogenetic relationship.

Monopterus albus;color;cytochrome b;genetic diversity

S917

A

1005-3832（2016）04-0006-05

2016-03-14

农业部行业（农业）科研专项（201003076）；安徽省农科院黄鳝创新团队（12c0501）；安徽省科技攻关项目（12010302056）.

凌俊，男，硕士，助理研究员.E-mail:fisherlling@163.com

江河，男，正高级工程师.E-mail:hfjianghe@sohu.com