循环肿瘤细胞在肺癌诊断中的研究进展

黄 璜综述，陈 虹审校（重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，重庆400016）

循环肿瘤细胞在肺癌诊断中的研究进展

黄 璜综述，陈 虹△审校
（重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，重庆400016）

肺肿瘤/诊断； 血液循环； 早期诊断； 预后； 综述

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率在恶性肿瘤中均位居前列［1-2］，约40%的肺癌患者在初诊时即合并远处转移［3］，从而严重影响肺癌患者预后。目前肺癌诊断方法（包括筛查血清肿瘤标志物、影像学检查、病理活检等）的安全性、准确性等不尽如人意。因此，新型肺癌诊断方法的探索存在需要的临床意义。循环肿瘤细胞（CTCs）作为“液体活检”，有助于肺癌诊断，可能成为未来肺癌诊断的重要方法。本文主要对CTCs在肺癌诊断中的研究进展作一综述。

1 肺癌诊断现状

肺癌是世界范围内癌症相关性死亡的主要原因，每年有大约 1 800万新发病例，5年生存率大概为15%［4-5］。目前有研究表明，未发生转移的早、中期肺癌患者的5年生存率约为发生转移者的13倍［6］，且早期肺癌患者有接受手术的机会，从而可提高肺癌患者的5年生存率［7］，故肺癌的早期诊断对于改善肺癌患者预后尤为重要。

肺癌的诊断方法包括筛查血清肿瘤标志物、影像学检查及病理活检。就目前已经广泛应用的肺癌肿瘤标志物来说，包括癌胚抗原、细胞角蛋白片段抗原21-1、鳞状细胞癌抗原及特异性烯醇化酶等，其敏感性及特异性仍远远低于理想值［8-9］。而影像学检查主要评估肿瘤位置及大小，不能良好地反映肺癌的恶性程度及侵袭能力［10］。病理活检是目前肺癌诊断的“金标准”，但病理活检作为一项有创操作，可能出现出血、气胸等并发症，同时由于各种限制，结果可能为阴性［11］。这些均导致了病理活检的应用低于临床期望值，制约了病理活检的发展。从而临床上迫切需要具备高敏感性和特异性的肿瘤标志物应用于肺癌诊断或筛查，补足目前诊断方法的缺陷。

2 CTCs的检测方法

2.1 CTCs概述 CTCs是指由原发肿瘤或转移灶上脱落下来进入血液循环的肿瘤细胞，其脱落的关键机制包括肿瘤对血管的内渗作用及肿瘤相关脉管系统软化使细胞被动脱落。CTCs具有与肿瘤原发灶一致的细胞学和遗传学特征，且在早期肿瘤甚至癌前病变患者的外周血中即可检测到CTCs。因此，CTCs作为“液体活检”在肺癌诊断中存在极大价值［12］。CTCs的临床应用对于肺癌的准确诊断提供了一种无创性的新型诊断方法，在肺癌的早期诊断中具有重要的临床意义。

CTCs在血液中的含量极少（1/106～1/107），因此为了将检测CTCs的敏感性提高到满意程度，富集技术便显得尤为重要。目前的富集方法包括使用免疫分离方法选取带有肿瘤特异性标记的靶细胞，以及根据形态标准选取相应细胞。CTCs经过富集技术浓缩后，即可通过细胞计数或反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等方法进行检测［13］。

2.2 富集技术 CTCs富集技术主要通过辨别细胞形态特征所完成，该方法使用免疫磁珠（阴性富集或阳性富集）及通过微流体进行免疫分离：（1）基于形态学的富集技术。对大于白细胞（＞8 μm）的细胞进行过滤，但目前鲜有研究证实所有的CTCs均大于8μm，故此种方法尚缺乏说服力［14］。（2）免疫磁珠。免疫磁性分选系统是用于捕获由磁珠所标记细胞的专门工具，通过细胞膜或细胞内染色达到目的，其后续步骤为透化及固定。例如CD326，其是参与细胞黏附的细胞表面分子，在大多数上皮癌中呈高度表达，以及肿瘤细胞抗原表皮生长因子受体2均可与用单克隆抗体所包被的磁珠结合，从而使CTCs的富集顺利进行［15］。（3）干细胞技术。干细胞技术是一种阴性富集技术，其原理为CD45+细胞和多个红细胞通过双特异性四聚体抗体复合物交叉结合成细胞团，随着这类非检测需要的细胞密度增加，密度梯度离心后，CD阳性的细胞聚集在下层，而CD阴性的单核细胞则被隔离在介质和等离子体之间，从而达到富集目的［16］。

2.3 细胞计数法 细胞计数法基于抗原表达的原理分离和计数单个细胞，其中作用于特异性上皮抗原的单克隆抗体得到广泛应用。与核酸检测法比较，细胞计数法可保持细胞的完整性，从而可更加深入地描述CTCs，同时以便进一步对CTCs进行形态及分子鉴别。但是细胞计数法的主要特点是当前特异性抗体的缺乏，但这个问题可通过对CD45进行复染弥补一部分。在提高敏感性和特异性方面，则可通过多标志物的应用来处理，这能够在一定程度上克服由于肿瘤的异质性带来的检测难题［17］。

2.4 核酸检测法 CTCs也可通过检测具有特定基因序列的肿瘤细胞来测定，如原癌基因或肿瘤抑制基因的DNA突变、致癌病毒序列的检测均可用于CTCs的鉴定。但由于DNA的变异仅仅发生在发育异常的病变或成熟的肿瘤中，故循环游离DNA可能仅仅反映了核酸的存在，而非肿瘤细胞的存在，故目前检测游离DNA并未用于临床实践。在临床实践中，更多使用的是通过检测mRNA来反映CTCs的存在，常用方法包括PCR、RT-PCR等。有研究表明，RT-PCR的敏感性优于免疫细胞化学，但遗憾的是，该研究无对照组的数据［18］。其中定量RT-PCR增加了正常细胞和肿瘤细胞的mRNA区分度的表达，但与细胞计数法相似，RT-PCR也存在缺少特异性组织标记的问题。由于正常细胞的标记有时难以与肿瘤细胞的标记相区分，导致核酸检测法具有较高的敏感性，但特异性却难以达到令人满意的程度，同时核酸检测法操作相对复杂，易受污染，应用也受到限制。

2.5 CellSearch系统 该系统是目前美国食品药物管理局唯一批准的CTCs检测方法。CellSearch系统是一种将富集和检测结合起来的半自动技术，分析检测的快速性及样本的可回收性是CellSearch系统的一大特色。CellSearch的检测原理是因为来源于中胚层的白细胞可表达CD45，而来源于外胚层的肿瘤细胞表达细胞角蛋白（CK）及上皮细胞黏附分子（EpCAM），但不表达CD45，故在富集过程中，采用CK和苯基吲哚（DAPI）进行荧光染色，造血细胞则由CD45进行对比染色，然后使用自动荧光显微镜筛选出EpCAM+/CK+/DAPI+/ CD45-的细胞，可将其界定为CTCs。国外有研究者证实，在使用CK、EpCAM及DAPI标记时，特异度可达100%［19］，但该项研究样本数较少，故CellSearch系统的在检测CTCs中的敏感性和特异性可能需要更多研究证实。

2.6 CTC-chip法 该法与CellSearch系统原理基本相同，在芯片上约有78 000个显微位点，每一个显微位点均包埋有EpCAM抗体，当检测样本通过芯片时，CTCs即可被位点捕获，该方法以CKs和DAPI为阳性，以CD45为阴性为标准［20］，从目前研究来看，CTC-chip具有更高的敏感性，可在1 mL血液中检测出CTCs，其分离纯度约为CellSearch的100倍，但因其局限于使用EpCAM检测CTCs，故CTC-chip法在应用过程中可能出现假阳性［21］。

2.7 酶联免疫斑点法（ELISPOT） ELISPOT可使用黏蛋白-1和CK19作为标记，去除CD45+的细胞，富集得到肿瘤转移相关蛋白（CXCR4）阳性的细胞，检测CTCs释放的特定蛋白质，因此可取得较高的敏感性和特异性［22］。目前还不存在CTCs检测的“金标准”，仍需通过不断努力研究提高上述方法的可靠性。

3 CTCs在肺癌诊断中的价值

肺癌的早期诊断对于选择治疗方式及提高肺癌患者的5年生存率至关重要，是改善肺癌预后的关键步骤之一。目前国内外针对CTCs在肺癌中的诊断价值都进行了较多的研究。有研究结果显示，CTCs在肺癌诊断中的敏感性为30.4%～89.0%，特异性为84.1%～100.0%［23-27］。其中Lou等［24］和Yu等［27］在2013年均设计了以PCR检测CTCs的研究，设计的临界值分别为8.64 CTCs单位及8.5 CTCs单位，对共计225例非小细胞肺癌患者进行了诊断，结果显示敏感度分别为73.20%和81.80%，特异度分别为84.10%和93.20%，其中Yu等［27］报道的曲线下面积（AUC）为0.823。Chen等［23］则在2014年应用荧光原位杂交技术（FISH）对50例非小细胞肺癌患者外血清内的CTCs进行了检测，临界值为每3.2毫升2个细胞单位，敏感度和特异度分别为84.00%、97.60%。而Fiorelli等［25］在2015年设计了以免疫组织化学为检测方法的相关研究，限定临界值为CTCs计数大于25个，对60例平均年龄为65.5岁的肺癌患者进行了CTCs筛查，得到的敏感度和特异度分别为89.00%、100.00%。上述4项研究均显示，CTCs具有较好的敏感性及特异性，但Tanaka等［26］于2009年报道的CTCs在肺癌中的应用数据显示（临界值为CTCs计数大于1个），125例肺癌患者中，真阳性、假阳性、真阴性及假阴性患者分别为38、3、22、87例，从而得到敏感度和特异度分别为30.40%、88.00%，AUC为0.598。

上述研究结果提示，CTCs在肺癌诊断的应用中虽具备较好的敏感性及特异性，但可能存在不足：（1）不同研究样本数的影响，在5篇文献中，样本数均偏小，可能是造成其敏感性波动范围较大的原因［23-27］；（2）研究对象中肺癌不同病理类型对于诊断结果的影响，如Lou等［24］和 Yu等［27］所报道的肺癌类型为非小细胞肺癌，其敏感性及特异性相对接近；（3）CTCs检测方法的不同，在上述文献中，其检测方法包括PCR、FISH、免疫细胞化学等，在进行CTCs检测时即可出现误差；（4）不同研究者对于临界值定义的不同，5位研究者其研究设计的临界值分别为8.64、2、8.5、25、1个CTCs单位，而临界值的设定直接关系到敏感性和特异性的计算，由此可见，在目前研究中，临界值差异可能是造成误差的主要原因之一；（5）纳入的肺癌患者分期的不同，目前研究表明，不同分期的肺癌可造成外周血中CTCs计数的不同，故在比较过程中，亚组分析是关键的一步，但Chen等［23］及 Fiorellli等［25］并未进行亚组分析。因此为确定CTCs在肺癌诊断中是否存在较大优势，可能需要更多、大型、前瞻性的研究证实。

综上所述，作为潜在的新型肺癌肿瘤标志物，CTCs具有较好的敏感性及特异性，是一种快速、无创的诊断方法，因此CTCs是一种有潜力的外周血肿瘤标志物，但仍需更多的研究评估其临床意义，从而指导临床应用。

［1］Vallières E，Pintos J，Parent ME，et al.Occupational exposure to wood dust and risk of lung cancer in two population-based case-control studies in Montreal，Canadat［J］.Environ Health，2015，14：1.

［2］Meza R，Meernik C，Jeon J，et al.Lung cancer incidence trends by gender，raceandhistologyintheunitedstates，1973-2010［J］.PloSOne，2015，10（3）：1-14.

［3］Lim E，Tay A，Von Der Thusen J，et al.Clinical results of microfluidic antibody-independent peripheral blood circulating tumor cell capture for the diagnosis of lung cancer［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2013，147（6）：1936-1938.

［4］Molina JR，Adjei AA，Jett JR.Advances in chemotherapy of non-small cell lung cancer［J］.Chest，2006，130（4）：1211-1219.

［5］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［6］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

［7］Yu JB，Soulos PR，Cramer LD，et al.Comparative effectiveness of surgery and radiosurgery for stage i non-small cell lung cancer［J］.Cancer，2015，121（14）：2341-2349.

［8］Okamura K，Takayama K，Izumi M，et al.Diagnostic value of cea and cyfra 21-1 tumor markers in primary lung cancer［J］.Lung cancer，2013，80（1）：45-49.

［9］ Chu XY，Hou XB，Song WA，et al.Diagnostic values of scc，cea，cyfra21-1 and nse for lung cancer in patients with suspicious pulmonary masses：a single center analysis［J］.Cancer Biol Ther，2011，11（12）：995-1000.

［10］Zieglschmid V，Hollmann C，Böcher O.Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2005，42（2）：155-196.

［11］Chen Q，Ge F，Cui W，et al.Lung cancer circulating tumor cells isolated by the epcam-independent enrichment strategy correlate with cytokeratin 19-derived cyfra21-1 and pathological staging［J］.Clin Chim Acta，2013，419：57-61.

［12］Ilie M，Hofman V，Long E，et al.Current challenges for detection of circulating tumor cells and cell-free circulating nucleic acids，and their characterization in non-small cell lung carcinoma patients.What is the best blood substrate for personalized medicine？［J］.Ann Transl Med，2014，2（11）：107.

［13］Mostert B，Sleijfer S，Foekens JA，et al.Circulating tumor cells（CTCs）：detection methods and their clinical relevance in breast cancer［J］.Cancer Treat Rev，2009，35（5）：463-474.

［14］Vona G，Sabile A，Louha M，et al.Isolation by size of epithelial tumor cells：a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells［J］.Am J Pathol，2000，156（1）：57-63.

［15］Allard WJ，Matera J，Miller MC，et al.Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases［J］.Clin Cancer Res，2004，10（20）：6897-6904.

［16］Naume B，Borgen E，Tøssvik S，et al.Detection of isolated tumor cells in peripheral blood and in BM：evaluation of a new enrichment method［J］.Cytotherapy，2004，6（3）：244-252.

［17］Connelly M，Wang Y，Doyle，et al.Re：Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and the detection of circulating normal-like breast tumor cells［J］.J Natl Cancer Inst，2009，101（12）：895.

［18］Smith BM，Slade MJ，English J，et al.Response of circulating tumor cells to systemic therapy in patients with metastatic breast cancer：comparison of quantitative polymerase chain reaction and immunocytochemical techniques［J］.J Clin Oncol，2000，18（7）：1432-1439.

［19］Balic M，Dandachi N，Hofmann G，et al.Comparison of two methods for enumerating circulating tumor cells in carcinoma patients［J］.Cytometry B Clin Cytom，2005，68（1）：25-30.

［20］Uhr JW.Cancer diagnostics：one-stop shop［J］.Nature，2007，450（7173）：1168-1169.

［21］Stott SL，Hsu CH，Tsukrov DI，et al.Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（43）：18392-18397.

［22］Alix-Panabières C，Vendrell JP，Pellé O，et al.Detection and characterization of putative metastatic precursor cells in cancer patients［J］.Clin Chem，2007，53（3）：537-539.

［23］Chen YY，Xu GB.Effect of circulating tumor cells combined with negative enrichment and cd45-fish identification in diagnosis，therapy monitoring and prognosis of primary lung cancer［J］.Med Oncol，2014，31（12）：240.

［24］Lou J，Ben S，Yang G，et al.Quantification of rare circulating tumor cells in non-small cell lung cancer by ligand-targeted pcr［J］.PloS One，2013，8（12）：e80458.

［25］Fiorelli A，Accardo M，Scrima M，et al.Circulating tumor cells in diagnosing lung cancer：clinical and morphologic analysis［J］.Ann Thorac Surg，2015，99（6）：1899-1905.

［26］Tanaka F，Yoneda K，Kondo N，et al.Circulating tumor cell as a diagnostic marker in primary lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15（22）：6980-6986.

［27］Yu Y，Chen Z，Dong J，et al.Folate receptor-positive circulating tumor cells as a novel diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer［J］.Transl Oncol，2013，6（6）：697-702.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.16.027

A

1009-5519（2016）16-2521-03

，E-mail：417335669@qq.com。

2016-03-01）