股骨头坏死患者外周血乙酰肝素酶表达水平检测及临床意义



股骨头坏死患者外周血乙酰肝素酶表达水平检测及临床意义

鲁会田

(郑州中医骨伤病医院,河南 郑州450016)

本研究总结了2010年2月-2014年2月间在我院进行股骨头坏死治疗的60例患者的临床资料，并检测这些患者的外周血乙酰肝素酶，并分析患者外周血乙酰肝素酶水平与临床诊断及治疗的关联，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1所需试剂血细胞裂解液(购自上海生工公司)；鼠抗人Hpa抗体、羊抗鼠HRP抗体(购自美国abcam公司)；其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.2主要仪器低温台式离心机(购自德国Thermo公司)；DYY-6C型高压电泳仪、DZY-E5电转仪(购自北京六一仪器厂)；-80℃超低温冰箱、高压灭菌器(购自日本SANYO公司)；凝胶成像分析仪(苏净安泰公司)等。

1.1.3一般资料 选取自2010年2月-2014年2月间在我院进行股骨头坏死治疗的60患者为研究对象。所有患者年龄为31-71岁，平均年龄51.72±7.24岁。其中男性患者为42例，女性患者为18例，病程为3-24个月。并以此期间来本院进行体检的健康者为对照组。

1.1.4纳入标准年龄为31-71岁，无饮酒史，无并发高血压、糖尿病、肿瘤等严重疾病，近期无急、慢性炎症病变，并且近期未使用抗凝或促凝等药物。

1.1.5排除标准年龄<31岁或>71岁。有饮酒史，并发高血压、糖尿病、肿瘤等严重疾病，近期有急、慢性炎症病变，并且近期使用了抗凝或促凝等药物。

1.2方法

1.2.1分组情况根据所有患者的影像学检测结果ARCO分期情况进行分组，共分为Ⅰ期组、Ⅱ期组、Ⅲ期组、Ⅳ期组4组，每组15例患者。并以此期间来本院进行体检的健康者为对照组，对照组为15例健康者。

1.2.2血样取材在患者入院后次日以及手术治疗1个月后采取患者的血液4 ml，对照组的健康者在体检时采血4 ml。在采血时需空腹，采取肘静脉血后每个样品加入40 μl的EDTA，在室温条件下静置20 min，放置在4℃离心机中3 000 rpm离心15 min，使用移液器吸取血浆，加入到清洁的EP管中，放置在-80℃超低温冰箱中保存留用。

1.2.3患者外周血乙酰肝素酶表达水平检测使用血细胞裂解液提取总蛋白，吸取10 μl蛋白样品，加入10 μl的2×上样Buffer，混匀后加入到浓缩胶的上样孔中，以60V的电压进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后切下含有目的条带的凝胶，放入电转仪后放入PVDF膜进行转膜。转膜完后将PVDF膜取出冲洗干净，加入鼠抗人Hpa抗体，放置在37℃条件下反应12 h，洗涤后向溶液中加入HRP标记的羊抗鼠抗体，室温下反应6 h，洗涤后使用DAB显色试剂盒对PVDF膜进行显色。使用凝胶成像分析仪对显色后的PVDF膜进行拍照，并使用Bandcan软件进行灰度值分析。

2结果

2.1患者基本资料

对所有患者的基本资料进行统计，结果显示，四组患者的例数、性别构成及平均年龄比较差异均不显著(P>0.05)。显示出四组患者的外周血乙酰肝素酶表达水平及病理检测结果具有一定的可比性，详细结果见表1。

2.2患者外周血乙酰肝素酶表达水平

检测患者治疗前后外周血乙酰肝素酶表达水平，结果显示，Ⅰ期组、Ⅱ期组、Ⅲ期组、Ⅳ期组患者在治疗后外周血乙酰肝素酶表达水平与对照组相比较差异均显著(P<0.05)。Ⅱ期组、Ⅲ期组患者在治疗后外周血乙酰肝素酶表达水平与对照组相比较差异均显著(P<0.05)。Ⅰ期组、Ⅱ期组、Ⅲ期组、Ⅳ期组患者在治疗前外周血乙酰肝素酶表达水平与治疗前相比较差异均显著(P<0.05)。详细结果见表2。

表1　患者基本资料

表2　患者外周血乙酰肝素酶表达水平

与对照组相比较差异显著*P<0.05，与治疗前相比较差异显著△P<0.05

3讨论

股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是一种骨科临床常见的疾病，但是临床治疗效果一般欠佳[1]。具体发病机制是当股骨头供血出现中断或受损的情况，从而造成骨细胞及骨髓成分死亡，之后便会使股骨头的结构发生改变、股骨头塌陷，患者的主要临床症状是关节功能障碍和关节疼痛。

乙酰肝素酶(heparannese,Hpa)是哺乳动物细胞中硫酸肝素蛋白多糖侧链-硫酸乙酰肝素的内源性糖苷酶，硫酸肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是Hpa 的天然底物，也是细胞外微环境的重要因子。Hpa可以降解 HSPG 的 HS 侧链，使细胞外基质的结构产生变化，在加速血管生成的同时，对周围炎症和肿瘤细胞的游走转移性有提高帮助作用，也会使HS 结合因子的释放有所增加[2,3]。

股骨头坏死的发病过程相对比较复杂，整个过程包括骨坏死、骨再生、纤维结缔组织增生，并且这几种情况相互交织出现。ARCOⅠ期股骨头坏死很少出现骨再生的情况，主要是骨坏死，周围血液为高凝状态[4]。ARCOⅡ，Ⅲ期时骨坏死以及血凝的程度均明显增加，并且出现骨再生的情况，这两个时期的乙酰肝素酶含量逐渐增加。在ARCO Ⅳ期中，乙酰肝素酶的含量明显较前减少，与ARCOⅠ期中含量相当[5]。

本研究对股骨头坏死患者外周血乙酰肝素酶表达水平进行检测，显示乙酰肝素酶表达水平与不同ARCO分期情况密切相关。其中Ⅱ期、Ⅲ期患者在治疗前后者外周血乙酰肝素酶表达水平均高于对照组的健康者。在进行手术治疗后，所有患者的外周血乙酰肝素酶表达水平均有所下降。表明检测患者外周血乙酰肝素酶表达水平可以对股骨头坏死情况进行诊断和预测，从而为临床提供更为简便快捷的诊断方法，并且这种检测方法对患者的伤害小，容易被患者及家属接受。

参考文献：

[1]成人股骨头坏死诊疗标准专家共识(2012 年版) [J].中华骨科杂志，2012，32(6):606.

[2]Parish CR,Freeman C,Hulett MD.Heparanase:a key enzyme involved in cell invasion[J].Biochim Biophys Acta，2001，1471:M99.

[3]Vlodavsky I,Friedmann Y.Molecular properties and involvement of hep-aranase in cancer metastasis and angiogenesis[J].J Clin Invest，2001，108:341.

[4]Lykissas MG,Gelalis ID,Kostas-Agnantis IP,et al.The role of hypercoa- gulability in the development of osteonecrosis of the femoral head[J]..Orthop Rev (Pavia)，2012，4(2):e17.

[5]Meirovitz A,Goldberg R,Binder A,et al.Heparanase in inflammation and inflammation-associated cancer[J].FEBS Journal，2013，280(10):2307.

文章编号：1007-4287(2016)01-0121-03

(收稿日期：2015-02-13)