藏药十五味龙胆花丸的体外抑菌活性研究

贺平　朱晓莉　刘航　李捷

【摘 要】 目的：观察藏药十五味龙胆花丸的体外抑菌活性，为临床用药提供实验依据。方法：采用琼脂平板打孔法研究十五味龙胆花丸对3种标准菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、沙门菌CMCC50319）及12株临床菌株的抑菌作用，并检测小鼠含药血清对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。结果：十五味龙胆花丸对金黄色葡萄球菌有明显的体外抑菌作用，但对革兰阴性菌抑菌作用较弱。对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度介于6.25～12.5mg/ml。结论：十五味龙胆花丸对耐药性金黄色葡萄球菌有一定的体外抑菌作用。

【关键词】 十五味龙胆花丸；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；抑菌

【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0003-03

Abstract：Objective To investigate the antibacterial activity of Tibetan medicine Shiwuweilongdanhua pills in vitro and provide theoretical basis for clinical application. Methods M-H agar-punching method was adopted to research the antibacterial activity of Shiwuweilongdanhua pills on three standard strains （Staphylococcus aureus ATCC25923， Escherichia coli ATCC25922， Salmonella CMCC50319） and 12 clinical isolates； and the antibacterial effect of mice serum on Staphylococcus aureus was detected.Result Shiwuweilongdanhua pills had obvious antibacterial effect on Staphylococcus aureus in vitro， but weak inhibition on Gram-negative bacteria. The minimal inhibitory concentrations to Staphylococcus aureus were between 6.25mg/ml and 12.5mg/ml.Conclusion Shiwuweilongdanhua pills had significant antimicrobial effect on multidrug-resistant Staphylococcus aureus in vitro， which indicated potential prospects in clinical application.

Keywords：Shiwuweilongdanhua pills； Staphylococcus aureus； Escherichia Coli； Antibacterial activity

藏药生境独特，药理功效强，引起了国内外的广泛关注。十五味龙胆花丸系藏医经典方剂，始载于藏医巨著《四部医典》，藏文名“帮间久埃”，为棕灰色水丸，气微香，味甘、辛、苦。主要由白花龙胆、檀香、诃子（去核）、余甘子、石灰华、广枣、丁香、肉豆蔻、沉香、巴夏嘎、无茎芥、甘草、毛诃子、木香、宽筋藤等15味药材组成。具有清热利肺、止咳化痰、平喘的功效[1]。目前，十五味龙胆花丸的研究主要集中在成分检测[2-6]及临床疗效观察，并用于治疗支气管炎[7]、咳嗽哮喘[8]、咽炎[9]等，尚未见药理研究的文献报道。研究旨在探讨十五味龙胆花丸消炎抗菌作用原理，为临床用药提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与实验动物 十五味龙胆花丸（西藏民族学院附属医院，每10丸0.3 g）。青霉素、卡那霉素标准药敏纸片（康泰生物有限公司）。实验动物均为雌性昆明小鼠（NO.61001700000554，SPF级），体重（20±2）g由西安交通大学实验动物中心提供。

1.2 实验菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923 （Staphylococcus aureus）、大肠杆菌ATCC25922 （Escherichia coli）、沙门菌CMCC50319（Salmonella）均由西安交通大学医学院提供；耐药性金黄色葡萄球菌5株、铜绿假单胞菌2株、耐药性肺炎克雷伯菌2株、耐药性大肠杆菌3株，由咸阳市中心医院检验科提供，菌株信息见表1。

1.3 仪器 Dade AutoScan-4半自动化细菌鉴定系统；BHC-1300ⅡA/B2型超净工作台（苏净集团）；Eppendorf 微量移液器； PH140A型干燥/培养箱（上海一恒科技有限公司）；DENVER T-214电子天平；GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱和YXQ-LS-75S立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；ZH-2型涡旋混合器；游标卡尺。

2 方法

2.1 药物准备 准确称量药物，然后在100 ml纯水中浸泡30 min，用文火煮沸30 min，冷却后离心取用上清液，并用少量纯水冲洗沉渣两次，冲洗液离心后取用上清液，将三次上清液合并浓缩至1000 mg/ml，用除菌滤器过滤后放置4℃备用。

2.2 菌液制备 将供试菌株在37℃培养18～20 h，取新鲜菌落用无菌水稀释成0.5麦氏比浊度的菌液，然后用平板涂布法进行体外抑菌实验。

2.3 平板打孔法抑菌实验 参照文献[10]用打孔器在M-H琼脂平板上等距离打6个的孔（直径6.5 mm），然后用无菌棉签蘸取0.5麦氏比浊度的菌液均匀涂布于平板，每个孔内加100 μl药液。根据预实验结果设置600、200、60 mg/mL三个浓度水平，以卡那霉素与青霉素药敏纸片作为对照。将平板37℃孵育24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。每株菌种做三个平行，并求取抑菌圈平均值。

2.4 最小抑菌浓度（MIC）测定 参照文献[11]采用微量肉汤稀释法测定敏感菌株MIC。取7支无菌试管，第一管加1.5 ml营养肉汤，其余各管均加1 ml营养肉汤；取0.5 ml 200mg/ml药液加入第一管涡旋30 s，混匀后从第一管取1ml至第二管，依次倍比稀释至第6管，最后从第6管取1 ml弃掉，药物浓度梯度为50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 mg/ml。用移液器依次向1～7支试管加入50 μL 0.5麦氏比浊度的菌液并混匀，第7管不加药物做阳性对照，另设无菌肉汤培养基做阴性对照，将所有试管置于37℃孵育24 h。将试管内培养液接种M-H琼脂培养18～20 h，以无菌落生长的试管作为该菌株的最小抑菌浓度。每个实验做三个平行，并求取MIC平均值。

2.5 血清学抑菌实验 根据打孔法抑菌实验结果，研究药物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。按照药物使用说明书和计量换算表确定小鼠给药中等剂量（0.625mg/ml）。低、中、高剂量组之间均相差3倍。经灌胃方式给药，连续给药5天后分离含药血清，然后进行含药血清抑菌实验。每株菌种做三个平行，并求取抑菌圈平均值。

3 结果

3.1 标准菌株抑菌结果 由表2可知，十五味龙胆花丸对金黄色葡萄球菌ATCC25923有显著的体外抑菌作用，且抑菌圈直径与药物浓度呈正相关；对G-菌株无抑菌作用较弱，600 mg/ml药物对大肠杆菌ATCC25922与沙门菌CMCC50319均未形成抑菌圈。

3.2 临床菌株抑菌结果 由表3可知，十五味龙胆花丸对5株耐青霉素的金黄色葡萄球均有显著抑菌作用，且抑菌圈直径与药物浓度呈正相关，但是对菌G-临床菌株抑菌作用较弱，仅在高浓度时对铜绿假单胞菌有抑菌圈形成。

3.3 MIC测定 观察试管中培养基透明度，同时转种M-H琼脂培养基观察细菌生长情况，得出敏感菌株的最小抑菌浓度。由表4可知，金黄色葡萄球菌MIC介于6.25～12.5 mg/ml。

3.4 血清学抑菌实验 十五味龙胆花丸对金黄色葡萄球菌的血清药理学抑菌实验表明，低、中、高剂量给药组的小鼠含药血清抑菌实验结果均为阴性。所用药物为十五味龙胆花丸药粉与纯水制备的混悬液，在高剂量组（1.875 mg/g-）灌胃时发现药液比较粘稠，小鼠灌胃给药过程相对比较困难，因此未采取提高给药剂量来增加药物血药浓度的措施。

4 讨论

十五味龙胆花丸由白花龙胆、檀香、诃子、丁香、巴夏嘎、木香等配伍而成。其君药为白花龙胆，《晶珠本草》记载龙胆花性味苦寒无毒，主治各种喉症，其活性与龙胆苦苷有关，后者具有清热泻火、镇咳利喉的作用[12]。诃子为独特的珍稀藏药材，具有广谱抗菌作用。诃子提取物对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌[13]和耐药性鲍曼不动杆菌[14]有显著的抑菌作用，但对大肠杆菌较弱。丁香中也是该方剂主要活性成分之一，丁香对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及沙门菌有明显的抑菌作用[15]。本研究首次探讨了十五味龙胆花丸的体外抑菌作用，发现该药对耐药性金黄色葡萄球菌有显著抑菌作用，对铜绿假单胞菌抑菌及沙门菌也有一定抑菌作用，对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌则无抑菌作用，与上述方剂组分的研究报道基本一致。根据Dade AutoScan-4细菌鉴定结果，本研究中耐药性金黄色葡萄球菌均为MRSA （methicillin-resistant Staphylococcus aureus），该菌已成为全球医院感染的主要病原体之一[16]，提示十五味龙胆花丸具有较好的临床应用前景。

藏药方剂与中草药方剂的药物成分比较复杂，不同成分之间存在扩散差异，而且没有标准纸片，实验结果质量较难控制。中药体外抑菌实验常用的研究方法[17]主要包括：肉汤稀释法、琼脂稀释法、纸片扩散法、牛津杯法、打孔法等。牛津杯法、打孔法与纸片扩散法原理相似，操作简便，而且药液扩散相对均匀。研究结果显示，牛津杯法扩散速度较慢，24h后部分牛津杯中仍有尚未扩散的药液，而且形成抑菌圈的效果较差。因此本研究的抑菌实验均采用平板打孔法。

十五味龙胆花丸方剂的化学成分极其复杂，经口服以后在体内会发生一系列变化，含药血清能更好的反映药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，特别适合复方进行药效评价及其作用机制的研究。所以在平板打孔法抑菌实验的基础上，采用血清药理学方法进一步研究了小鼠含药血清对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。低、中、高剂量给药组抑菌实验结果均为阴性。由此推测十五味龙胆花丸体内抗感染疗效并不完全依赖血清药物浓度，可能通过调节机体免疫功能等途径实现抗炎止咳的疗效。且有研究表明诃子可以调节细胞因子分泌，从而有效地增强机体非特异性免疫功能[18]；丁香具有抗菌和增强体液免疫的作用[15]。因此有必要进一步考察该药物对机体免疫功能的影响。

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（收稿日期：2015.12.06）