银杏黄酮对人单核细胞泡沫化形成的作用研究

陈薇　刘力豪　刘婉赢　王良波　蔡琨　罗坤

【摘 要】 目的：银杏黄酮具有多种生理活性，是临床治疗和预防心脑血管疾病的首选天然药物。通过观察银杏黄酮对人单核细胞THP-1源性泡沫细胞胆固醇含量的影响，探讨银杏黄酮对人单核细胞THP-1泡沫化形成的机制。方法：以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导人THP-1单核细胞源性巨噬细胞形成泡沫细胞模型，通过油红O染色观察银杏黄酮对泡沫细胞形成的影响，胆固醇氧化酶法测定细胞内总胆固醇蓄积情况。结果：利用ox-LDL能使人单核细胞THP-1形成稳定的泡沫细胞模型，用银杏黄酮干预后，泡沫细胞中总胆固醇的含量显著减少。结论：银杏黄酮能抑制 THP-1 源性泡沫细胞的形成，并减少 THP-1 源性泡沫细胞内脂质含量。

【关键词】 银杏黄酮；THP-1源性巨噬细胞；泡沫细胞；胆固醇

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0021-02

动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是一种严重威胁人类健康的疾病，由 AS所致的心血管疾病已成为我国居民死亡的主要原因。银杏在我国中药应用中有悠久的历史，药用范围十分广泛，主要的活性成分为银杏黄酮及内酯类。其中，银杏黄酮具有多种生理活性，是较好的天然抗氧剂，能清除生物体内过剩的自由基，阻止体内脂质过快氧化，改善神经调节作用，提高机体的免疫力，抑制细胞凋亡，抗肿瘤、抗衰老等，是临床治疗和预防心脑血管疾病的首选天然药物[1]。

动脉粥样硬化发生的早期事件和关键环节是胆固醇酯的沉积和巨噬细胞源性泡沫细胞的形成[2-4]，减少细胞外胆固醇流入细胞内，将有利于防止泡沫细胞形成，进而达到防治动脉粥样硬化的目的。研究以THP- 1源性巨噬细胞为研究对象，观察银杏黄酮对巨噬细胞泡沫化形成的影响，探讨银杏黄酮在动脉粥样硬化防治中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 细胞株 THP-1细胞购自武汉典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要试剂 银杏黄酮（中国药品食品检验检疫所）；胎牛血清、 PRMI 1640 培养基（美国 Hyclone 公司）；ox-LDL、PMA （Sigma公司）；胆固醇试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.1.3 仪器 二氧化碳培养箱、离心机（美国 Thermo 公司）；全自动酶标仪（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 精确称取银杏黄酮10mg溶解在1ml的DMSO，使用前用培养基稀释至终浓度400 mg/L、200 mg/L、100mg/L。

1.2.2 细胞培养 将THP-1细胞置于含10%胎牛血清和5%青链霉素混合液的RPMI1640培养基中，于 37°、5%CO2培养箱静置培养，细胞浓度控制在 1×108～9×108个/ml，每两天换液一次，每四天传代一次，传至2～3代用于实验。

1.2.3 泡沫细胞模型的建立 取对数生长期的THP-1细胞，用终浓度为160mmol/L的PMA孵育24h，诱导分化为巨噬细胞后加入终浓度为60mg/L的ox-LDL共培养48h，即得泡沫细胞。

1.2.4 实验分组 将人THP-1单核细胞经上述方法诱导分化为巨噬细胞后，调节细胞浓度为1×108～9×108个/ml，接种于96孔板，随机分为六组：空白对照组：用RPMI 1640完全培养基培养48h；泡沫细胞模型组：用终浓度为60mg/L的ox-LDL共同培养48h；银杏黄酮高浓度组：加入60mg/L的ox-LDL预孵24h，再加入400mg/L的银杏黄酮刺激24h；银杏黄酮中浓度组：加入60mg/L的ox-LDL预孵24h，再加入200mg/L的银杏黄酮刺激24h；银杏黄酮低浓度组：加入60mg/L的ox-LDL预孵24h，再加入100mg/L的银杏黄酮刺激24h；DMSO对照组：加入60mg/L的ox-LDL预孵24h，再加入20ml/L的DMSO培养24h。细胞培养终止后，用油红O染色鉴定泡沫细胞模型，用胆固醇氧化酶法检测细胞内胆固醇含量。

1.2.5 油红O染色[5] 细胞培养终止后，倒去培养液，用PBS轻缓漂洗三次，用冰冻的4%多聚甲醛固定5min，PBS洗一次，加入0.5%油红O丙二醇溶液，置于60℃烤箱染色30min，用60%丙二醇冲洗5min，再用PBS洗三次，置显微镜下观察并拍照。

1.2.6 细胞内总胆固醇测定 细胞培养终止后，将各组细胞吸去上清液，用PBS洗3遍，避免影响细胞内胆固醇测定。按比例每106个细胞加0.1ml裂解液，混匀吹打细胞，静置10min，使细胞充分裂解。随后取500ul细胞裂解液转移到1.5ml离心管里，室温2000rpm离心5min，收集上清液用于酶学测定。取 190 μl 工作溶液加入96孔板，在各工作液中，分别加入10 μl标准品、DMSO（空白对照）及各组待测样品。 37℃反应 20 min然后进行测定，将96孔板置于酶标仪中，调节测定波长570nm开始测定各孔OD值。

1.3 统计学处理 计量数据均以（x±s）表示，组间比较采用单向方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对泡沫细胞形成的影响 模型组显微镜下观察，细胞体积增大，胞浆疏松化，细胞浆内有大量红色脂滴存在，符合泡沫细胞的形态学特点（见图1a）。银杏黄酮高浓度组细胞数量减少，细胞散在分布，胞浆疏松，胞浆内未见明显脂滴（见图1b）；银杏黄酮中浓度组细胞数量较高浓度组较多，细胞体积较模型组小，细胞内脂滴少见，可见培养基内散在红色脂滴（见图1c）；银杏黄酮低浓度组细胞较多，散在分布，细胞体积较小，可见细胞周围散在红色脂滴（见图1d）。

2.2 银杏黄酮对泡沫细胞内胆固醇含量的影响 与空白组相比，模型组总胆固醇含量增加，差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，银杏黄酮高、中、低剂量组总胆固醇含量明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），且随着药物作用浓度的增大效果越明显。见表1。

3 讨论

动脉粥样硬化变化的关键环节是巨噬源性泡沫细胞的形成。泡沫细胞的形成主要由单核细胞在血管内皮细胞受损时通过内皮间隙，在内膜下分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过A型清道受体吞噬大量ox-LDL，导致细胞内脂质大量堆积，形成泡沫细胞[6]。泡沫细胞胞质中含有脂质空泡，其内脂滴存在的主要脂质是胆固醇酯。研究用人THP-1单核细胞，与终浓度为160mmol/L的PMA孵育24h。诱导分化为巨噬细胞后加入终浓度为60mg/L的ox-LDL共培养48h，采用油红0染色，显微镜下观察，细胞体积增大，胞浆疏松化，细胞浆内有大量红色脂滴存在，符合泡沫细胞的形态学特点，细胞内总胆固醇含量也较空白对照组多，说明已建立THP-1源性泡沫细胞模型。

银杏叶的药用历史悠久，李时珍的《本草纲目》中对其有详细记载。现代研究证明，银杏叶富含的黄酮类活性物质具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等。临床观察证明，银杏黄酮具有防止动脉硬化的功效，但具体机制尚不清楚。研究发现在诱导THP-1细胞泡沫化的过程中加入不同浓度的银杏黄酮作用后，细胞内红色脂滴减少，细胞内总胆固醇含量减少，且有明显的剂量-反应关系，表明银杏黄酮可以减少巨噬细胞中胆固醇的蓄积，减缓泡沫细胞形成。总胆固醇的蓄积是形成动脉粥样硬化的主要原因，总胆固醇含量过高，会引起粥样斑块的沉积，因此减轻细胞内的脂质负荷量，可能是银杏叶抗动脉粥样硬化的机制之一。但具体通过何种途径减缓泡沫细胞形成、抑制泡沫细胞内的脂质蓄积，仍需进一步研究。

参考文献

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[4]Schmitz G， Grandl M.Lipid homeostasis in macrophages-implications for atherosclerosis[J]. Rev Physiol Biochem Pharmaco，2008， 160： 93-125.

[5] 唐朝克，王佐，易光辉，等.Rolipram对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响[J].中国药理学通报，2003，19（10）：1177-1182.

[6]Hansson GK. Inflammationatherosclerosis and coronary artery disease[J].N Engl J Med，2005，352（16）：1685-1695.

[7]彭道泉，赵水平，聂赛，等.载脂蛋白E与过氧化物体增殖物激活型受体-Y基因多态性的相互作用及其与冠心病的关系[J].中华心血管病杂志，2002，30（6）：351-355.

（收稿日期：2015.10.26）