海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价*

张丽娜，王明义，杨小蕾，曹　源，张萍萍，胡成进△

(1.辽宁医学院，辽宁锦州 121001；2.威海市立医院，山东威海 264200；3.济南博科生物

科技有限公司，山东济南 250100；4.济南军区总医院，山东济南 250031)



·论著·

海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价*

张丽娜1，王明义2，杨小蕾3，曹源4，张萍萍1，胡成进4△

(1.辽宁医学院，辽宁锦州 121001；2.威海市立医院，山东威海 264200；3.济南博科生物

科技有限公司，山东济南 250100；4.济南军区总医院，山东济南 250031)

摘要:目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术，建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法，并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因，根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物；对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增，并做特异性比较；对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释，提取DNA后进行灵敏度的检测，并与常规PCR作比较；构建含vvhA基因片段的重组质粒，作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果，而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增，其他样品均为阴性，无假阳性和假阴性结果，表明引物的特异性较好，加入钙黄绿素和电泳结果相一致；针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10 CFU，是常规PCR(每个反应4×102CFU)的10倍，呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍，PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法，该方法特异性强，灵敏度高，方便快捷，特别适合用于现场和床旁的快速检测。

关键词:海洋；创伤弧菌；环介导等温扩增；快速诊断；聚合酶链式反应

海洋创伤弧菌是一种分布于亚热带浅海水域及海产品中的革兰阴性弧菌，该菌的生长繁殖环境不同于陆地菌种，具有高盐、高钠、低温、乏氧、寡营养的特点，人主要通过生食生蚝等海产品感染，从而导致胃肠炎等消化系统疾病[1]，或者经海水浸泡感染伤口致蜂窝性组织炎或菌血症等，此类感染进展迅速，病死率高达50%[2]，尤其对肝功能低下的患者易感。海洋创伤弧菌因其生长繁殖的特殊性，未引起实验室的足够重视，且缺乏专业培养基对其进行鉴定，使得感染后存在鉴定困难。传统的鉴定方法主要是分离培养和生化鉴定，这类方法繁琐、费时、费力，并且存在易受人为和试剂的影响或需要昂贵的微生物鉴定系统的缺陷[3]。随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(PCR)为代表的病原菌核酸快速检测技术得到了广泛应用，但它们都需要昂贵的特殊仪器、试剂和专业技术人员，检测成本较高，不适合基层及现场的快速检测[4]。2000年日本学者Notomi等[5]发明了一种新型的基因诊断技术，即环介导等温扩增(LAMP)技术。该技术是在链置换型DNA聚合酶的作用下，利用特别设计的4段引物来识别靶基因的6个区域，恒温条件下(60～65 ℃)1 h内就可以对目的基因进行高效、特异的复制[6-9]。此外，该技术无需购置昂贵的PCR分析仪，操作简单，可用于现场的快速检测，近年来已得到广泛应用。本研究针对海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因设计了4条引物，建立快速诊断海洋创伤弧菌的LAMP技术，可视化判断结果，并对该方法进行了应用评价。

1材料与方法

1.1菌株来源本实验所用的菌株共47株，其中海洋创伤弧菌(M06)为韩国首尔大学食品生物技术与毒理营养研究所Sang Ho Choi惠赠，其余弧菌属细菌来源于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(青岛)，其他菌株均为济南军区总医院临床分离保存菌株。

1.2仪器与试剂恒温金属浴(济南博科生物科技有限公司)，低温高速离心机Centrifuge 5430R(德国Eppendorf公司)，荧光凝胶成像分析系统(美国UVP公司)，TC-XR型基因扩增仪(日本BIOER公司)。Bst DNA聚合酶(8 U/μL)购于New England Biolabs公司，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP，10 mol/L)和DNA标记物均购于大连宝生物工程有限公司，钙黄绿素购于北京蓝谱科技有限公司，所有试剂均在有效期内使用。

1.3方法

1.3.1细菌培养及DNA模板的制备按常规操作规程采用三区划线法取弧菌属细菌接种于2216E平板，培养温度为28 ℃。非弧菌属细菌接种于血平板，培养温度为37 ℃，置于培养箱中培养过夜。采用煮沸法提取细菌DNA：取50 μL双蒸水(ddH2O)于1.5 mL EP管中，调菌液至1～2个浊度，震荡15 s，煮沸10 min后立即冰浴3 min，13 000 r/min离心5 min，取上清作为DNA模板，-20 ℃保存备用。革兰阳性菌则需要加入溶菌酶后煮沸提取。

1.3.2LAMP引物的设计与合成根据GenBank数据库中收集的vvhA基因序列进行LAMP引物设计(http://primerexplorer.jp/e/)，筛选出一套最佳引物(2对)，其中两条外引物为F3、B3，内引物为FIP、BIP(引物序列见专利申请内容)，设计好的引物交由Invitrogen公司合成。

1.3.3LAMP反应体系总体积25 μL，具体组分包括：10×缓冲液、dNTP、引物、甜菜碱、硫酸镁(MgSO4)、Bst酶、钙黄绿素、DNA模板等(专利申请内容)，轻微混匀瞬时离心后加入20 μL灭菌液体石蜡密封，置于恒温金属浴中，反应条件设置为63 ℃，1 h；85 ℃，5 min终止反应。

1.3.4vvhA基因的克隆和阳性对照的建立用LAMP实验的两条外引物F3/B3进行PCR扩增，反应体系(25 μL)：模板2 μL、Premix Taq 12.5 μL、F3/B3(5 μmol/L)各1 μL、ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃ 8 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 8 min；共30个循环。扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，将217 bp的扩增目的片段切胶回收后，与PMD18-T载体连接，16 ℃ 2 h后4 ℃冰箱过夜。将连接产物转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃培养过夜后挑取单克隆菌落摇菌后经PCR验证送测序，测序成功后提取质粒作为标准阳性对照。

1.3.5LAMP反应产物的判断(1)肉眼判读结果：反应结束后肉眼观察结果，反应液由橙色变为绿色则判为阳性，保持橙色则判为阴性。(2)琼脂糖凝胶电泳：6 μL扩增产物与1 μL上样缓冲液混匀点样于含0.1 μL/mL GoldviewⅠ型核酸染料的2%琼脂糖凝胶中，100 V电泳25 min，电泳显示LAMP特征性梯状条带则判为阳性，否则判为阴性。

1.3.6PCR和LAMP法检测创伤弧菌的特异性分析将4株海洋创伤弧菌、3株副溶血弧菌、3株哈维弧菌、3株美人鱼弧菌、3株查格斯弧菌、2株海洋溶藻弧菌、1株费氏弧菌、1株弗氏弧菌，临床分离的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、嗜麦芽假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌各3株用上述反应体系进行LAMP和常规PCR检测。

1.3.7PCR和LAMP法检测海洋创伤弧菌的灵敏度将海洋创伤弧菌M06株增菌液培养过夜后，进行10倍系列倍比稀释，从101～109稀释液中各吸取20 μL至无菌平皿中，倾注冷却的2216E液体培养基后混匀，每个稀释度做两个平行，37 ℃培养48 h计数菌落数。吸取各浓度稀释液1 mL，提取DNA后用上述扩增条件同时进行LAMP和PCR检测。

2结果

2.1vvhA基因的克隆和阳性对照的建立用F3/B3作为引物，普通PCR扩增，电泳显示条带与目的条带大小一致(217 bp)，见图1。将此条带切胶回收成功与PMD18-T载体连接，并转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基中，过夜培养PCR验证后测序结果显示已成功构建含vvhA目的片段的重组质粒，可以作为LAMP实验的标准阳性对照。

M：DNA分子量标记物DL2000;T:vvhA基因片断阳性扩增。

图1PCR vvhA电泳结果

2.2PCR和LAMP法检测海洋创伤弧菌的特异性分析以vvhA基因重组质粒为标准阳性对照，ddH2O为阴性对照，PCR和LAMP技术检测上述菌株。结果显示，常规PCR除4株海洋创伤弧菌出现阳性外，1株副溶血弧菌、1株海洋溶藻弧菌也出现阳性；而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增，其他样品均为阴性，无假阳性和假阴性结果，表明引物的特异性较好，加入钙黄绿素和电泳结果相一致。见表1。

2.3PCR和LAMP法检测海洋创伤弧菌的灵敏度分析海洋创伤弧菌MO6培养物进行倾注平板计数，已测定的初始菌液浓度为2×108CFU/mL，10倍倍比稀释的菌液浓度分别为2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101CFU/mL。所对应反应体系中的浓度为每个反应4×104、4×103、4×102、4×101、4×100、4×10-1、4×10-2CFU。对不同稀释度的模板DNA进行常规PCR(F3/B3作引物)和LAMP实验，发现针对vvhA基因设计的引物最低检测下限为每个反应4×10 CFU，是常规PCR(每个反应4×102CFU)的10倍，呈现较好的灵敏度。两种实验方法检测海洋创伤弧菌的灵敏度分析结果见图2，LAMP检测海洋创伤弧菌灵敏度显色分析见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。重复实验过程两遍，PCR和LAMP法检测结果稳定。

A：LAMP实验；B：常规PCR；M：DNA分子量标记物DL2000；1：浓度为每个反应4×104CFU；2：浓度为每个反应4×103CFU；3：浓度为每个反应4×102CFU；4：浓度为每个反应4×10 CFU；5：浓度为每个反应4×100CFU；6：浓度为每个反应4×10-1CFU；7：浓度为每个反应4×10-2CFU；8：阴性对照；9：阳性对照。

图2两种实验方法检测创伤弧菌的灵敏度分析

3讨论

随着海洋作业活动的日益频繁，海洋致病菌感染性疾病的发生逐年增加，但是由于海洋致病菌自身生长特点使其在临床实验室常规培养条件下难以生长，导致不能正确检出而漏诊，对此应引起医学实验室的高度重视。在海洋致病菌中创伤弧菌致病力最强，感染后常导致菌血症及器官衰竭[10-12]。本研究采用LAMP技术建立了一种快速检测海洋创伤弧菌感染的方法。构建了重组质粒作为检测体系的阳性对照，并对此方法进行了特异性和灵敏度的评价。

本研究的核心技术在于引物的设计，需要考虑以下几个方面。(1)熔解温度(Tm)值： F1c/B1c引物区的Tm值控制在64～66 ℃，F2/B2、F3/B3则控制在59～61 ℃，LF/LB引物的Tm值约为60 ℃。(2)引物末端的稳定性：引物作为DNA合成的起点，其末端必须要有一定的稳定性，⊿G为吉布斯自由能变，该值越小，引物越容易与模板退火结合。设计原则为F3/B3、F2/B2、LF/LB的3′端⊿G值小于或等于-4 kcal/mol，F1c/B1c的5′端⊿G值小于或等于-4 kcal/mol。(3)GC百分含量：引物的GC百分含量在40%～65%。(4)引物之间的距离：F2与B2之间的距离(LAMP的扩增区域)为0～60 bp，F2与F3之间的距离为0～60 bp，而F2的5′端与F1的5′端的距离(环引物的区域)为40～60 bp[13]。

常规PCR需要配套控温精密的仪器和复杂的实验程序，检测成本高[14]。而本研究所用的LAMP技术无需PCR仪，仅使用一台恒温金属浴即可，操作简单，并且本实验使用47株细菌检测该方法的特异性，结果显示只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增，其他样品均为阴性，无假阳性和假阴性结果，且该方法特异性明显高于常规PCR。另外，LAMP检测海洋创伤弧菌的最低检测限度达到每个反应40 CFU，灵敏度是常规PCR的10倍。

LAMP检测结果判读有浊度分析、电泳分析、染料比色分析等多种方式[15]。但是观察浊度具有主观性及灵敏度低等缺点，而通过电泳分析或者在反应完成后添加SYBR GreenⅠ荧光染料来判断反应结果都使反应产物暴露于空气中，极易造成假阳性，而反应扩增之前加入SYBR GreenⅠ会抑制LAMP反应的进行[16]。本研究中使用的钙黄绿素检测，将整个反应和检测融合为一个过程，而且反应完成后不开盖，很好地杜绝了污染，有效防止了假阳性[17]。

综上所述，LAMP技术快速检测海洋创伤弧菌用时少、操作简单、特异性强、灵敏度高，且结果判读简单。在63 ℃条件下扩增1 h，便可根据颜色变化用肉眼来判定是否存在海洋创伤弧菌。近年来有报道显示，聚乙二醇可以加速LAMP反应的进行[18]，相信采用LAMP技术检测海洋创伤弧菌的方法将会逐渐完善并应用于临床。笔者下一步研究将着重优化反应体系，提高引物纯度，进一步提高反应的灵敏度，缩短反应时间，为该方法在临床的推广应用奠定基础。

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Establishment and evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detecting marine Vibrio vulnificus*

ZhangLina1，WangMingyi2，YangXiaolei3，CaoYuan4，ZhangPingping1,HuChengjin4△

(1.LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China；2.WeihaiMunicipalHospital,

Weihai,Shandong264200,China；3.Ji′nanBiobaseBiotechCo.,Ltd,Ji′nan,Shandong250100,China；

4.GeneralHospitalofJi′nanMilitaryRegionofPLA,Ji′nan,Shandong250031,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid,convenient,sensitive and specific method for the detection of marine Vbrio vulnificus by using loop-mediated isothermal amplification(LAMP) technique,and evaluate the specificity and sensitivity of this method.MethodsAccording to marine Vibrio vulnificus cytolysin(vvhA) gene sequence published by GenBank,a set of LAMP primers were designed.LAMP and polymerase chain reaction(PCR) amplification were carried out in 47 strains of bacteria(including 20 strains of Vibrio) and specificities of LAMP and PCR were compared.Serial ten-fold dilutions of an overnight Vibrio vulnificus M06 culture were prepared in sterile saline solution,and compared the sensitivity of LAMP with that of PCR after extracting DNA templates.A recombinant plasmid containing fragment of vvhA gene was constructed and set as a standard positive control of LAMP assay.ResultsFalse-positive results occurred in the conventional PCR,while in the LAMP assay positive amplifications were only seen in strains of Vibrio vulnificus and no false-positive or false-negative results were generated among 47 strains of bacteria,which indicated that primers had high specificity.Additionally,the results of electrophoresis were consistent with those after adding the calcein.The detection limit of LAMP was 4×10 CFU each reaction for detecting vvhA gene in pure culture,which was 10-fold more sensitive than that of conventional PCR(4×102CFU each reaction).It indicated that LAMP assay had good sensitivity.Repeated the test twice,the detection results of LAMP and PCR were both stable.ConclusionAn LAMP detection method for marine Vibrio vulnificus has been developed,which is highly specific,sensitive,convenient and suitable for rapid field detection and point-of-care testing.

Key words:marine；Vibrio vulnificus；loop-mediated isothermal amplification；rapid diagnosis；polymerase chain reaction

基金项目：全军“十二五”科研重点项目(BWS12J014)。

作者简介：张丽娜，女，检验技师，主要从事分子生物学研究。 △通讯作者，E-mail：hcj6289@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.001

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0577-04

(收稿日期：2015-10-10)