某院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLVA基因分型及流行状况研究*

陈　扬，胡大春，崔　颖，王　林，刘德华，邵剑春，穆士杰△

(1.第四军医大学唐都医院输血科，陕西西安 710038；2.昆明市第一人民医院检验科，云南昆明 650011)



·论著·

某院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLVA基因分型及流行状况研究*

陈扬1，胡大春2，崔颖1，王林1，刘德华2，邵剑春2，穆士杰1△

(1.第四军医大学唐都医院输血科，陕西西安 710038；2.昆明市第一人民医院检验科，云南昆明 650011)

摘要:目的通过构建适合临床实验室常规应用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株同源性多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)分型方法，建立昆明地区临床分离MRSA菌株的MLVA基因分型基础数据库，分析医院MRSA感染流行情况。方法收集昆明市第一人民医院临床微生物室2010年10月至2013年12月分离的111株MRSA菌株，对7个可变数目串联重复序列(VNTR)位点进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和产物电泳分析，归类各菌株的基因型别。结果VNTR09-01位点测序结果显示9 bp的重复子，重复规律性不强、易突变；111株分离株被分为25个基因型别(A～Y)，其中G、A、B为主要型别，分别占47.7%、13.5%、8.1%；呼吸内科、神经外科、重症监护室(ICU)和乳腺科存在MRSA集中流行趋势。结论MLVA分型方法可推广应用于本研究中7个VNTR位点多态性检测，部分科室存在MRSA同源菌集中流行情况，值得高度关注。

关键词:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；基因分型；多位点可变数目串联重复序列分型

1961年，英国学者Jevons首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)[1]。2011年美国感染病学会(IDSA)MRSA感染治疗指南——《IDSA-2011-MRSA指南》中报道，美国医院细菌感染中MRSA感染率为31.8%，远超其他细菌感染率[2]，其所致感染呈散发、流行，甚至暴发[3-4]。我国金黄色葡萄球菌临床分离株中MRSA所占百分比增至50%以上[5]，根据2011年中国CHINET细菌耐药性监测数据[6]，MRSA仅对噁唑烷酮类、利奈唑胺、万古霉素等糖肽类抗菌药物敏感。MRSA引起医院感染的暴发已成为重点关注的公共卫生问题之一。本研究构建适合临床实验室常规应用的MRSA菌株同源性多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)分型方法，建立本地临床分离MRSA菌株的MLVA基因分型基础数据库，分析MRSA的医院流行情况，为制订有效控制措施提供客观依据。

1材料与方法

1.1菌株来源收集昆明市第一人民医院检验科微生物室2010年10月至2013年12月临床分离鉴定的MRSA菌株111株。

1.2仪器与试剂MicroScan WalkAway 40 SI全自动细菌鉴定及药敏分析系统(德国西门子公司)；聚合酶链式反应(PCR)试剂、50 bp DNA标记物(美国Fermentas公司)；琼脂糖(西班牙Biowest公司)。

1.3MRSA临床菌株的分离培养与鉴定参照《全国临床检验操作规程》(第3版)的临床病原微生物分离培养方法进行菌株的分离培养，根据血浆凝固酶试验，金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)单克隆抗体检测和MicroScan WalkAway 40 SI全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行菌种鉴定和抗菌药物敏感性试验。

1.4MRSA菌株DNA提取采用离心柱法提取高浓度的模板DNA。

1.5可变数目串联重复序列(VNTR)位点多态性检测方法的建立

1.5.1引物设计与合成本研究参考Schouls等[7]在S.aureus strain N315基因组序列中寻找的VNTR序列位点，采用BLASTN进行引物序列比对和特异性验证后，从中选取7个分辨力和分型能力较好的位点，由上海生工公司合成其侧翼特异性引物，见表1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

1.5.2反应体系和条件上、下游引物各1.5 μL，Taq缓冲液5 μL，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)4 μL，氯化镁(MgCl2)4 μL，DNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶1.4 μL，双蒸水补至50 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，退火30 s(各自引物的Tm值-5 ℃)，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃后延伸10 min。

1.5.3结果检测与分析配制2%的琼脂糖凝胶，用50 bp DNA标记物确定其相对分子质量。用50 bp DNA标记物作为相对分子质量对照，按照产物片段大小确定其多态性情况，即人工估算出各细菌株各VNTR序列位点的基序重复次数。

1.6所构建的PCR方法对菌株VNTR多态性检测的验证

1.6.1重复性验证从研究菌株中抽取24株，每株MRSA用7对引物进行不同位点VNTR多态性扩增检测3次，分析3次产物的一致性。

1.6.2正确性测序验证选取14株研究菌株(编号为1～14号)，分别对所构建的7个VNTR位点多态性PCR检测方法进行测序验证。

1.7临床分离MRSA菌株的MLVA分型数据库建立对7个VNTR位点及其核心基序重复次数进行编号，然后分别对111株临床分离MRSA菌株中每一株细菌进行7个VNTR位点多态性组合编码，并根据其编码进行MLVA型别归类，得出MLVA分型数据库数据。

1.8临床分离主要MLVA型别菌株的流行趋势分析根据MLVA分型结果及菌株分离的时间，分析主要MLVA型别菌株的流行时间分布及病房分布情况。

2结果

2.1PCR方法对菌株VNTR多态性检测的重复性验证从研究的MRSA菌株中抽取24株，每株MRSA在不同VNTR位点重复检测3次，每次DNA扩增片段大小完全相符。

2.2PCR方法对菌株VNTR多态性检测的正确性测序验证选取14株研究菌株(编号为1～14号)，分别对所构建的7个VNTR位点多态性PCR检测方法进行测序验证，VNTR09-01位点的9 bp重复子规律性不强，碱基突变率较高。VNTR位点序号2上游引物扩增产物测序结果见图1、2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)，其中重复子基序为60 bp，3、4号研究菌株分别重复0次(见图1)和7次(见图2)。其余各VNTR位点引物扩增产物测序序列图略。

2.3111株临床分离MRSA菌株6个VNTR位点的多态性检测部分菌株(24株)中6个VNTR基因位点的多态性检测结果，见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。各位点的VNTR多态性变化，见表2。

2.4111株临床分离MRSA的MLVA基因分型依据6个VNTR序列位点多态性在111株临床分离MRSA菌株中的变化信息，对各株细菌进行基因VNTR多态性编码，具有相同编码的菌株归类为同一分型类别中，得到111株临床分离MRSA菌株的MLVA基因型别归类数据库。111株分离株可分为25个基因型别(A～Y)，其中G、A、B为主要型别，分别占47.7%(53/111)、13.5%(15/111)、8.1%(9/111)。

2.5主要MLVA型别菌株的流行趋势分析根据MLVA分型结果及菌株分离的时间进行分析，主要MLVA型别菌株的流行时间分布情况见图4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)；病房分布情况见图5(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)，呼吸内科、神经外科、重症监护室(ICU)和乳腺科存在MRSA集中流行趋势。

3讨论

目前，脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)作为细菌分子分型的“金标准”而被首推[8]，但其操作繁琐、费时。2009年，Schouls等[7]对529株金黄色葡萄球菌分别采用MLVA、Spa和PFGE 3种分型方法进行比较，结果显示MLVA与PFGE有相似多样性指数。2010年陶晓霞等[9]参考Sabat选取的5个VNTR位点对49株MRSA进行了MLVA分型，结果显示该方法与PFGE具有较好的符合率。此外，在Pourcel等[10]收集的300株MRSA研究中，显示MLVA与多位点序列分型(MLST)和Spa分型方法相比有较强的分辨力，且另有研究证明VNTR的重复性和稳定性更好[11]。在本研究选取的7个VNTR位点中，6个位点的分辨力和分型能力较好，操作较PFGE更为简单易行、快速，在临床实验室具有较好的可操作性，值得推广应用。

本研究在对2010年10月至2013年12月收集到的111株分离自住院患者临床标本的MRSA进行MLVA型别归类后，发现呼吸科、神经外科、ICU和乳腺科在以上时间段内存在MRSA集中流行趋势。医务人员的手是引起医院MRSA感染的重要传播途径之一，由医务人员的手传播细菌而造成的医院感染占30%左右[9]。因此，应进一步提高医务人员手卫生依从性，努力阻断MRSA的传播途径。

综上所述，MLVA可推广应用于本研究中7个VNTR位点多态性检测，该院部分科室存在MRSA同源菌集中流行情况，值得高度关注。

参考文献

[1]Klevens RM，Edwards JR，Tenover FC，et al．Changes in the epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in intensive care units in US hospital,1992-2003[J]．Clin Infect Dis，2006，42(3)：389-391．

[2]Liu C，Bayer A，Cosgrove SE，et al．Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of America for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in adults and children[J]．Clin Infect Dis，2011，52(3)：18-55．

[3]Hussain FM，Boyle-Vavra S，Bethel CD，et al．Current trends in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus at a tertiary care pediatric facility[J]．Pediatr Infect Dis J，2000，19(12)：1163-1166．

[11]Ma C，Deng XL，Ke CW，et al．Epidemiology and etiology characteristics of foodborne outbreaks caused by vibrio parahaemolyticus during 2008-2010 in Guangdong province,China[J]．Foodborne Pathog Dis，2014，11(1)：21-29.

[12]Haenen OL，van Zanten E，Jansen R，et al．Vibriovulnificus outbreaks in Dutch eel farms since 1996:strain diversity and impact[J]．Dis Aquat Organ，2014，108(3)：201-209.

[13]Torres C，Vitalis EA，Baker BR，et al．LAVA:an open-source approach to designing LAMP(loop-mediated isothermal amplification) DNA signatures[J]．BMC Bioinformatics，2011，12(2)：1-7.

[14]Dhama K，Karthik K，Chakraborty S，et al．Loop-mediated isothermal amplification of DNA(LAMP):a new diagnostic tool lights the world of diagnosis of animal and human pathogens:a review[J]．Pak J Biol Sci，2014，17(2)：151-166.

[15]Goto M，Honda E，Ogura A，et al．Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxynaphthol blue[J]．Biotechniques，2009，46(3)：167-172.

[16]Zong XJ，Wang WW，Wei HR，et al．Rapid detection of Prunus necrotic ringspot virus using magnetic nanoparticle-assisted reverse transcription loop-mediated isothermal amplification[J]．J Virol Methods，2014(208)：85-89.

[17]Fischbach J，Xander NC，Frohme MA．Shining a light on LAMP assays-A comparison of LAMP visualization methods including the novel use of berberine[J]．Biotechniques，2015，58(4)：189-194.

[18]Nose K，Nagamine K，Tokuda J，et al．Polyethylene glycol accelerates loop-mediated isothermal amplification(LAMP) reaction[J]．Yakugaku Zasshi，2013，133(10)：1121-1126.

MLVA genotyping and the prevalence status analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from a hospital*

ChenYang1，HuDachun2，CuiYing1，WangLin1，LiuDehua2，ShaoJianchun2，MuShijie1△

(1.DepartmentofBloodTransfusion,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China；2.DeparmentofClinicalLaboratory,theFirstPeople′sHospitalofKunmingCity,Kunming,Yunnan650011,China)

Abstract:ObjectiveTo establish multiple-locus variable-number tandem repeat assay(MLVA) genotyping database for clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) in Kunming area and analyse the prevalence status of MRSA in hospital,through establishing a classification method for MRSA by homology MLVA which was appropriate to routine application in clinical laboratory.MethodsA total of 111 strains of MRSA isolated by the Clinical Microbiology Chamber of the First People′s Hospital of Kunming City from October 2010 to December 2013 were collected.The polymerase chain reaction(PCR) amplification and electrophoresis for analysis of PCR products were carried out for the seven sites of variable number tandem repeats(VNTR),classification of strain based on genotypes was carried out,as well.ResultsThe sequencing results of VNTR09-01 site showed 9 bp repetitive sequence elements whose regularity was not strong,and the repetitive elements was mutable.The 111 isolates were divided into 25 kinds of genotypes(A-Y),among which genotype G,A and B were the main types,accounted for 47.7%,13.5% and 8.1% respectively.ConclusionMLVA could be generally applied in the seven sites of VNTR in this study.Some departments might exit concentrated epidemic of homologous MRSA strains,which is worthy of being paid more attention.

Key words:methicillin-resistant Staphylococcus aureus；genotype；multiple-locus variable-number tandem repeat assay

基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目(2010C097)。

作者简介：陈扬，女，住院医师，主要从事临床微生物学与检验研究。 △通讯作者，E-mail:musj1963@fmmu.edu.cn。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.004

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0586-03

(收稿日期：2015-11-26)