耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定*

马洪玉，兰小鹏，陈　敏

(南京军区福州总医院检验科,福建福州 350025)



·论著·

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定*

马洪玉，兰小鹏，陈敏△

(南京军区福州总医院检验科,福建福州 350025)

摘要:目的构建编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a (PBP2a)转肽酶区基因片段的原核表达载体，并表达、纯化及鉴定蛋白。方法从临床标本中分离鉴定MRSA，设计针对编码PBP2a转肽酶区基因片段的引物，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段，克隆至pET28a(+)载体，双酶切鉴定并测序，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS株；用0.7 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后，利用Ni亲和层析技术纯化目的蛋白；蛋白免疫印迹法(WB)鉴定重组蛋白。结果重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，产物在预期大小处出现条带，测序结果显示有两个碱基突变，无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和WB鉴定，在相对分子质量38×103处可见一新生蛋白条带。结论成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体，并获得了高效表达，制备了高纯度的目的蛋白。

关键词:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；mecA基因；青霉素结合蛋白2a；转肽酶区

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是医院感染的重要病原菌之一，该菌对多种β-内酰胺类抗菌药物具有内在耐药性，给临床治疗带来严重困难[1-2]。主要耐药机制为MRSA获得mecA基因，编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a与β-内酰胺类抗菌药物亲和力很低，因而使得MRSA对大多数抗菌药物耐药[3]。PBP2a由N-末端跨膜区、非青霉素结合区和转肽酶区3部分组成。本研究采用从临床分离鉴定的MRSA菌株，应用基因重组技术将编码PBP2a转肽酶区的DNA片段克隆至大肠杆菌表达载体，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，并对重组蛋白进行了纯化和鉴定，为后续相关研究打下基础。

1材料与方法

1.1菌株来源MRSA临床分离株、质粒pET28a(+)均由本室保存；大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)plysS株购自全式金生物技术有限公司。

1.2材料与方法聚合酶链式反应(PCR)所用试剂Taq MIX、限制性核酸内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA连接酶均购自日本Takara公司；PCR纯化、质粒提取及胶回收试剂盒购自上海生物工程股份有限公司；Ni亲和层析预装柱购自美国Novagen公司；PCR扩增仪购自杭州博日科技有限公司；凝胶成像仪购自珠海黑马医学仪器有限公司；兔抗PBP2a抗体购自Rio Ray公司。

1.3方法

1.3.1PCR扩增目的基因片段根据已公布的mecA基因序列，由Invitrogen(上海)公司合成一对寡核苷酸引物，上游引物：5′-CGG GAT CCA CTA TTG ATG CTA AAG TTC A-3′；下游引物：5′-GGA ATT CGC AAC CCA CGT TAC CGG ATT G-3′[4]。用接种针挑取本院检验科微生物实验室保留的MRSA菌落，加入双蒸水18 μL，Taq MIX 20 μL，上下游引物各1 μL，混匀，94 ℃预变性10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。

1.3.2重组表达载体的构建PCR所获得的目的基因片段经1%琼酯糖凝胶电泳，按胶回收试剂盒说明书回收纯化后用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，并与同样酶切的pET28a(+)载体T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a感受态菌。通过酶切鉴定筛选出阳性重组子，并将阳性重组子送至Invitrogen(上海)公司进行序列测定。

1.3.3重组蛋白的表达将重组质粒转化表达菌株BL21(DE3)plysS，然后挑取单个菌落，接种至含卡那霉素抗性的LB培养基中，37 ℃ 220 r/min振荡培养过夜后，以1∶100转接于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃培养至吸光度值(A值)为0.6，取1 mL作为对照，其余加100 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.7 mmoL/L，继续诱导培养5 h，取1 mL培养液离心收集细菌，重悬于50 μL磷酸盐缓冲液(PBS)中，加等体积2×上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，取10 μL进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

1.3.4重组蛋白的复性将1 mL过夜培养的菌液转接种于100 mL含卡那霉素的LB培养基中，按上述方法诱导目的蛋白的产生；4 ℃离心收集沉淀物，将沉淀用40 mL的缓冲液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10 mmol/L乙二胺四乙酸，1% Triton X-100)重悬，冰浴中超声破碎，10 000 r/min离心10 min收集沉淀；以40 mL的缓冲液A洗涤包涵体两次，离心去上清，称量包涵体净重；加入40 mL缓冲液B[50 mmol/L 3-环己基氨基-1-丙磺酸，pH11.0，3% N-十二烷基肌胺酸钠和1 mol/L二硫苏糖醇(DTT)]轻轻混匀，室温孵育15 min，10 000 r/min离心10 min至溶液澄清。将含有可溶蛋白的上清转入透析袋中，每次透析所用缓冲液体积为2 000 mL缓冲液C(0.02 mol Tris-HCl，pH8.5，0.1 mmol/L DTT)4 ℃透析3 h，透析两次，以缓冲液D (即不加DTT的缓冲液C)继续透析两次，以加入终浓度分别为1.0、0.2 mmol/L的还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽缓冲液D，4 ℃透析过夜；4 ℃ 1 000 r/min离心10 min去除沉淀，0.45 μm滤器过滤。

1.3.5重组蛋白的纯化预装柱经结合缓冲液(0.5 mol NaCl，5 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)平衡后，4 ℃条件下，将透析后的液体上样，控制流速为10 mL/h，依次用10 mL结合缓冲液、10 mL漂洗缓冲液(0.5 mol NaCl，60 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)、5 mL洗脱缓冲液(0.5 mol NaCl，1 mol imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)洗柱，分别收集洗脱液。分别取10 μL洗脱液加入等量2×SDS上样缓冲液，混匀，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE电泳。

1.3.6蛋白免疫印迹法(WB)鉴定重组蛋白取5 μL纯化蛋白液，加等体积2×SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE电泳，以未诱导菌的提取液做对照，经转膜、封闭、结合稀释1 000倍兔抗PBP2a一抗、稀释2 000倍的羊抗兔二抗体后，发光鉴定，标定标记物，进行扫描。

2结果

2.1PCR扩增目的基因片段扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，约1 000 bp附近可见清晰的扩增条带，与目的片段预期大小一致。见图1。

M：DNA分子量标记物。

图1PCR扩增目的基因片段

2.2重组表达载体的酶切鉴定和测序重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，产物在预期大小(1 026 bp)处出现条带，见图2。测序结果与基因文库登录的目的片段序列(GenBank：X52593)仅有两个碱基位点不一致，无移码突变，核酸同源性为99.8%。见图2。

M：DNA分子量标记物；1、2：非目的克隆酶切产物；3：目的克隆酶切产物。

图2BamHⅠ/EcoRⅠ酶切重组表达载体

2.3重组蛋白的表达与纯化重组质粒转化菌经IPTG诱导后，在相对分子质量约38×103处新增明显条带，与理论相对分子质量一致。0.7 mmoL/L IPTG诱导的蛋白条带最深。见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.4重组蛋白的鉴定经过WB纯化的重组蛋白在38×103附近有明显的阳性条带，而对照菌的提取液则为阴性。见图4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

3讨论

自20世纪60年代报道MRSA以来，MRSA所致的医院感染率逐年上升，成为全球关注的严重医院和社区感染病原菌[5-6]。MRSA是多重耐药菌，耐药性的遗传决定子为mec，长约(30～50)×103，位于细菌染色体上，由mecA、mecI、mecRI及(20～40)×103的mec相关DNA 组成。mecA为结构基因，编码产生PBP2a蛋白。PBP2a含有668个氨基酸，相对分子质量为78×103，该蛋白由N-末端跨膜区、非青霉素结合区和转肽酶区3部分组成，其中转肽酶区内含β-内酰胺类抗菌药物作用位点[7-8]，在细菌耐药中起主要作用。

目前，MRSA感染的诊断和治疗策略主要以PBP2a为靶标[9-10]，PBP2a蛋白的表达是前提。本研究应用PCR技术扩增PBP2a转肽酶区基因片段1 026×103，测序结果与基因文库登录的目的片段序列仅有两个碱基位点不一致，无移码突变，核酸同源性为99.8%。在重组蛋白的表达中笔者做了大量的试验，使用不同表达载体，包括谷胱甘肽巯基转移酶(GST)表达载体的PGEX-4T、HIS表达载体的pet-22b、pet-28a。在不同的IPTG诱导浓度(0.4、0.7、1.0 mmoL/L)，不同的诱导时间(2、4、6、8、12 h)，不同的温度(16、20、25、30、37 ℃)下检测，均为包涵体表达的蛋白，证实在浓度0.7 mmoL/L的IPTG 37 ℃诱导6 h，蛋白的表达量最大，诱导其在大肠杆菌中高效表达。随后应用Ni亲和层析对重组蛋白进行了纯化，笔者优化了溶解包涵体，结合、漂洗和洗脱条件，得到了高纯度蛋白。

本实验所表达的PBP2a蛋白经SDS-PAGE电泳和WB鉴定，在相对分子质量38×103处均可见一新生蛋白条带，与MRSA-PBP2a转肽酶区的相对分子质量相吻合，说明已成功诱导了PBP2a转肽酶区蛋白，对PBP2a的分子生物学特性做了进一步探索，为MRSA感染的临床诊断和防治方法的研究提供了理论基础，将极大地推进MRSA感染难题的攻克。

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Cloning,prokaryotic expression,purification and identification of the transpeptidase domain of penicillin binding protein 2a of methicillin-resistant Staphylococcus aureus*

MaHongyu，LanXiaopeng，ChenMin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:ObjectiveTo construct the prokaryontic expression vector of the gene fragment which encodes the transpeptidase domain of penicillin binding protein 2a(PBP2a) of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),and to express,purify and identify the objective protein.MethodsStrains of MRSA were isolated and identified from clinical samples,according to the sequence of mecA gene recorded in GenBank,the primers of mecA fragment which encoded the transpeptidase domain of PBP2a was designed.The gene fragment from MRSA was amplified by using polymerase chain reaction(PCR) and cloned into pET28a(+) plasmid.After being identified by enzyme digestion and sequencing,the recombinant plasmid was transformed into the strain of Escherichia coli BL21(DE3)plysS.The expression of transpeptidase domain of PBP2a was induced by 0.7 mmol/L IPTG,the expressed products were purified by using Ni afinity chromatography,then were analyzed by using Western blot.ResultsThe recombinant expression vector was digested by BamHⅠ and EcoRⅠ,and the products were at the expected size.The result of sequencing showed two bases undergoing mutation,while there were no frameshift mutations.The expressed protein was identified by using SDS-PAGE and Western blot,a new protein band was visible at the relative molecular mass of 38×103.ConclusionThe corresponding prokaryotic expression vector is successfully constructed,and the transpeptidase domain of PBP2a is successfully expressed and purified．

Key words:methicillin-resistant Staphylococcus aureus；mecA gene；penicillin binding protein 2a；transpeptidase domain

基金项目：福建省科技计划社会发展重点项目(2012Y0058)。

作者简介:马洪玉，女，主管检验技师，主要从事临床微生物与检验研究。 △通讯作者，E-mail：fzcmin@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.008

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0597-03

(收稿日期：2015-10-22)