中药体内代谢研究方法与技术*

王娟娟，冯　芳,2

(1 中国药科大学药物分析教研室，江苏　南京　210009;2 药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏　南京　210009)



专论与综述

中药体内代谢研究方法与技术*

王娟娟1，冯芳1,2

(1 中国药科大学药物分析教研室，江苏南京210009;2 药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏南京210009)

传统中药在我国使用历史悠久，但是其活性成分及作用机制仍然不明确。体内代谢研究在探索药物药效基础，了解药物的代谢途径，以及代谢物毒性评价方面发挥重要作用。但是中药进入体内后含量低，成分更复杂，需要建立灵敏、专属、准确的检测方法。本文通过查阅近年文献，介绍了样本处理、目标物质分离与检测的方法与技术在中药体内代谢研究中的应用。

中药；体内代谢；方法；技术

传统中药在我国的使用已逾数千年，是中国传统文化的瑰宝。传统中医使用的经典方剂多为几味药材通过中医理论合理配比组合而成，这些复方中含有的化学成分少则几十种，多则可达上千种。如此多的成分在进入体内后既有互相促进也会有拮抗作用，其在体内的药效活性成分既可能是原型成分也可能是代谢产物。通常认为，药物必须吸收入血，分布到靶器官，而且在相应的靶器官处在一定时间段内维持一定的浓度水平才可能发挥药效作用[1]。研究药物体内代谢可以了解药物在体内的存在形式，药物代谢途径以及药物发挥作用的物质基础。探索药物在体内的代谢过程将为阐明药物活性成分提供有用信息，为药物的作用机制和安全性评价提供理论依据，为新的活性成分的发现提供重要来源。

1　中药体内代谢研究的难点

研究中药在体内的代谢过程具有重要意义，但也充满挑战。首先，传统中药化学成分结构复杂多样，如经典方剂大承气汤中含四味药材，其中来源于其君药大黄的成分就多达75个[2]。对这些成分尤其是一些痕量成分进入体内的原型及代谢物的检测是非常困难的。其次，研究药物体内代谢，其样本常来自血浆，尿液，胆汁和粪便等，这些生物基质含有多种内源性成分，如血浆中含有多种蛋白质，尿液中则含有尿酸，尿素，以及多种无机盐等，待测物经常被这些内源性杂质掩盖。最后，不同于单一化学药品，中药中大部分成分缺少对照品，更不用说相应的代谢物了，所以，试图通过仅有的标准品对药物在体内的代谢物进行识别是不可能实现的[3-4]。因此，在药物体内代谢研究中建立高效，灵敏，专属的分析方法是至关重要的。

2　样本处理

药物及其代谢物进入体内后存在于复杂的生物基质中，如何有效地将这些目标化合物提取出来是影响体内代谢研究的重要因素。体内样品的前处理技术迅速发展，出现了许多分离与浓集的新方法和新技术，如液相萃取，液相微萃取，固相萃取，自动化固相萃取，固相微萃取，超滤及微透析技术。其中液液萃取，固相萃取以及蛋白沉淀法仍是目前使用最多的样本预处理方法，现将其分别叙述如下。液液萃取是利用待测物与干扰物质在不同溶剂中的溶解度不同对其进行提取，因此，液液萃取多用于极性跨度比较小的物质的纯化，即适合于对结构相近的化合物的提取。姜悦[5]在对4种蒽醌成分在大鼠体内组织分布的研究中，在组织匀浆液中加入重蒸乙酸乙酯提取蒽醌，结果提取回收率在91.3%～104.6%之间，满足方法学验证要求。该实验中目标物质为蒽醌，其结构接近且极性较小，所以采用乙酸乙酯可以获得较高提取回收率。固相萃取是利用色谱理论，采用装有不同填料的小柱进行体内药品处理的方法。目前以C18柱最为常用，一般是将中等极性及弱极性化合物与极性干扰物质分离[6]。为了扩大固相萃取柱的适用范围，使其对极性较弱的物质和极性较强的物质均有保留，亲水亲脂柱开始被应用。这种柱子的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按照一定比例聚合成的大孔共聚物。但是相比于常规固相萃取柱，这种小柱价格较昂贵。蛋白沉淀法是利用有机溶剂如甲醇，乙腈等，将生物基质中的蛋白质沉淀析出，从而将待测物质分离出来，蛋白沉淀法常用于血浆样本的预处理。吕磊等[7]在200 μL给药血浆中加入400 μL乙腈，将血浆中的蛋白质沉淀，从而提取淫羊藿在大鼠血浆中的原型药物与代谢物。最终鉴别出3个入学成分和4个代谢物。

3　样本分离与检测

3.1HPLC技术在中药体内代谢研究中的应用

如前所述，中药材中含有的成分纷繁复杂，结构多样。药物进入体内经吸收代谢后，其含量降低，结构变得更加复杂，除了原型药物还包括相应的代谢物，因此有效地分离这些物质是决定其检测成败的重要因素。高效液相色谱(HPLC)是目前使用范围最广的分离技术，不同化学结构的固定相填料使得HPLC技术几乎适合于分离所有化合物。根据不同的固定相填料，HPLC有不同的分离机制，但是目前在中药体内代谢研究中使用最多的还是C18为主的的反相色谱柱，以乙腈-水或甲醇-水系统作为流动相，通过待测物化学性质在流动相中加入其它物质使待测物更好的分离，如甲酸或者乙酸。邵明晶等[8]通过比较不同酸度对色谱峰分离及出峰顺序的影响，发现大黄酸峰位受酸度影响较为明显。在样本干扰较小，分离度大于1.5，出峰时间相对较短的条件下，最终选择0.1%乙酸-甲醇作为流动相用于蒽醌物质的分离分析条件。超高效液相色谱技术(UPLC)采用粒径小于2μM的填料作为固定相，这极大地提高了色谱分离技术的分离效率，缩短了分析时间，峰形更好，特别适合于分离含有多种成分的中药及其在体内的代谢物。杨杰等[9]采用UPLC技术分析小柴胡汤提取液化学成分及其在抑郁模型大鼠体内的代谢产物，在25 min内在血清样品中检测到8个代谢物，尿液中检测到19个代谢物。

3.2质谱技术在中药体内代谢研究中的应用

飞行时间质谱检测器(TOF/MS)和三重四极杆质谱检测器(QqQ/MS)是药物体内代谢最常用的质谱检测器。TOF/MS主要应用于待测物的定性分析，通过从质谱图上获得的准分子离子以及碎片离子的精密质量可以推测待测物的可能元素组成。TOF/MS的高灵敏度，高分辨率与高扫描速度特点使其特别适合与HPLC技术联用对代谢物进行鉴别。QqQ/MS包括四种扫描模式，即母离子扫描，产物离子扫描，中性丢失扫描以及多反应监测，其中，前面三种应用于定性分析，最后一种适合于定量分析，如中药进入体内后特征成分的血药浓度测定[10]。三种定性分析技术中又以产物离子扫描和中性丢失扫描方式最为常用。QqQ/MS中，第一级与第三级四极杆发挥检测作用，中间一级作碰撞室用。在产物离子扫描方式中，第一级四极杆中的离子只有符合设定的质荷比才能进入碰撞室，其碰撞产生的离子在第三级四极杆被检测。通过实验可以获得选定的前体离子的特征碎片，从而对其进行鉴别。在中性丢失扫描模式中，第一级四极杆中的所有离子都可以进入碰撞室，在第三级四极杆检测器中，只有能丢失特定碎片的母离子才可被记录。中性丢失在代谢物研究中具有重要作用，因为代谢物在体内的II相代谢产物包括葡萄糖醛酸、硫酸等缀合物，所以中性丢失在鉴别这类化合物时具有不可替代的优势。Xing等[11]在QqQ/MS的产物离子扫描方式和中性丢失扫描方式的基础上，建立了结合多产物离子过滤技术和中性丢失过滤技术的分析方法。利用对照品获得皂苷类化合物特征产物离子，及特征中性丢失质量，从而成功对大鼠粪便中三七皂苷的原型药物及代谢物进行鉴别。

4　结　论

液相色谱质谱联用技术具有灵敏度高，专属性强，准确度高，分析速度快的特点，其在中药体内代谢研究中的广泛应用，为探索中药药效物质基础，研究中药作用机制和安全性评价提供了重要信息，从而促进中药现代化与国际化。

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[5]姜悦,冯芳.HPLC-荧光法测定4种蒽醌成分在大鼠体内组织分布的研究[J].广州化工,2015(6):125-128.

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[7]吕磊,赵亮,张海,等.快速液相-高分辨飞行时间质谱技术鉴别大鼠血中淫羊藿及其代谢产物[J].第二军医大学学报,2013,34(10):1104-1107.

[8]邵明晶,冯芳.蒽醌在正常及酒精肝损伤大鼠的药动学比较[J].广州化工,2015,43(6):53-56.

[9]杨杰,黄丹雪,鹿秀梅,等.小柴胡汤化学成分及其在抑郁模型大鼠体内代谢成分的分析[J].中草药,2012,43(9):1691-1698.

[10]张静泽,王磊,金兆祥,等.中药胃肠安丸给药后木香烃内酯及去氢木香内酯药代动力学研究[J].中国中药杂志,2015,40(6):1173-1178.

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Methods and Technologies for Metabolism Study of Traditional Chinese Medicine*

WANG Juan-juan1,FENG Fang1,2

(1 Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Jiangsu Nanjing 210009; 2 Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance (Ministry of Education),Jiangsu Nanjing 210009,China)

Traditional Chinese medicine (TCM) has been used in china for a long history.But the activity compounds and action mechanism are not clear.The metabolism research of TCM is important for exploring activity compounds,understanding metabolic pathways and evaluating drug safety.The constituents in vivo are complex and in low quantity,and a sensitive,special and accurate method is needed.The method of sample pretreatment as well as separation and detection technology applied in metabolism study of TCM was introduced by referring to literatures published recently.

TCM; metabolism; methods; technologies

国家自然科学基金资助项目 (No:81274063)。

王娟娟，硕士在读。

冯芳，教授，从事现代药物质量研究及评价。

R917

A

1001-9677(2016)011-0001-02